[發明專利]一種葡萄snRNA U6 基因及其引物和應用

在審

• 申請號: 201810093700.8
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108034657A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 王鵬飛;任鳳山;王詠梅;吳新穎;蔣錫龍;楊立英
• 申請（專利權）人: 山東省葡萄研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

本發明公開了一種葡萄snRNA U6基因及其引物和應用，本發明首次鑒定得到了葡萄snRNA U6基因，并設計了該基因用于實時熒光定量PCR的引物。實驗證明，該基因及引物可以用于葡萄基因及葡萄miRNA的實時熒光定量PCR分析，該葡萄snRNA U6基因在葡萄各個組織及冷脅迫條件下表達量穩定，可靠性較好。本發明snRNA U6基因可以作為實時熒光定量PCR的內參基因，U6基因是目前公認的最適合用于作為miRNA熒光定量的內參基因，以snRNA U6為內參做出的表達結果與miRNA測序表達譜高度吻合，有利于少量miRNA的表達分析，操作相對簡單，成本較低，靈敏度高。

技術領域

本發明涉及一種葡萄snRNA U6 基因、進行實時熒光定量PCR擴增該基因的引物以及該基因作為葡萄miRNA定量PCR檢測的內參基因的應用。

背景技術

miRNA（MicroRNA) 是一類在生物界中廣泛存在的小分子非編碼單鏈RNA，長約21～24nt，它能通過降解或抑制互補的靶mRNA來進行轉錄后基因表達調控，并且在生物的各個發育時期和不同的組織器官中廣泛表達，參與到生物的各種生理活動中，因其在生物中的重要性，近幾年國內外科學家對miRNA 的研究倍加重視。對葡萄miRNA 的研究有助于推動葡萄種植業的發展。葡萄中只報導了187 條miRNA，對miRNA的定量研究的較少。

目前對miRNA的表達分析主要有高通量測序，基因芯片和實時熒光定量PCR法三種。其中，高通量測序和基因芯片法為高通量監測的方法，成本很高，不適于少量miRNA 的功能分析，并且需要利用實時熒光定量PCR方法來驗證。而基于SYBR Green 染料熒光定量PCR 的miRNA 相對定量法表達分析有著操作相對簡單，成本較低，靈敏度高的優勢，廣受研究人員的歡迎。在相對定量中，內參的選擇尤為重要。目前內參的選擇大多數采用一些表達相對恒定的管家基因，如snRNA U6，5S rRNA 等。U6 基因是一種核剪切子RNA，參與到pre-mRNA的加工剪切，它的序列比較保守，在不同的物種中同源性高，相比較其他內參基因，snRNA U6更普遍的作為miRNA定量分析的內參基因。但是葡萄snRNA U6基因序列和引物尚未有相關報道，更沒有以葡萄U6 基因作為內參基因來對葡萄miRNA進行定量的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供葡萄snRNA U6 基因和擴增該snRNA U6基因的引物，本發明通過研究首次得到葡萄snRNA U6 基因并提供了擴增該基因的引物，該引物能準確的特異性的擴增出葡萄snRNA U6 基因，該基因在葡萄各個組織、冷脅迫誘導下的表達均很穩定，為葡萄miRNA 定量PCR檢測提供了可用的內參。

本發明的另一目的是提供該葡萄snRNA U6 基因作為葡萄miRNA 的定量PCR檢測的內參基因的應用，還提供了采用實時熒光定量PCR檢測葡萄miRNA的方法。該方法采用本發明snRNA U6基因為內參，所得表達結果與miRNA組高通量測序表達譜高度吻合，準確率高。

葡萄snRNA U6基因屬于一種非編碼的小RNA，在目前公布的葡萄基因組中沒有關于非編碼小RNA的信息。雖然U6基因在各個物種中有一定的保守性，但不同物種的U6基因還是存在其本身的特異性，要對葡萄的miRNA 進行實時熒光定量PCR檢測，必須使用葡萄的U6基因作為內參才可以，采用其他物種的U6基因不可行，存在準確率無法保障的問題。并且，不同物種的U6基因序列之間雖然相似度較大，但是即使一個堿基的差別也會影響引物設計的精確性，只有針對具體的基因序列設計出的特定引物才能實現對序列的準確擴增，不同物種U6基因的引物也無法通用。發明人通過小RNA組高通量測序、同源克隆結合的方法從葡萄中首次鑒定得到了葡萄snRNA U6基因，并設計了該基因的PCR引物，可以方便快捷的擴增出該基因，為其作為內參基因提供了技術支持。

本發明具體技術方案如下：