[發明專利]一種抗凋亡蛋白PTD-FNK蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201810093457.X
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108373508A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 李珣;王曉曄;胡傳活;石博妹;李丹丹;劉蛟;陳正;趙艷
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70
• 代理公司: 桂林市持衡專利商標事務所有限公司 45107
• 代理人: 湯凌志

本發明提供一種抗凋亡蛋白PTD?FNK蛋白及其制備方法。以大鼠肝臟總RNA為模板，通過分子克隆技術及基因點突變技術，構建PTD?FNK蛋白的原核表達載體pET28a(+)?PTD?FNK質粒，并將其轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中低溫誘導PTD?FNK的可溶性表達并分別從上清和沉淀中提取蛋白。

技術領域

本發明涉及一種抗凋亡蛋白PTD-FNK蛋白及其制備方法。

背景技術

Bcl-xL蛋白被認為是一個潛在的治療細胞異常凋亡的蛋白，然而Bcl-xL一旦被磷酸化，其抗凋亡活性就會被抑制，限制了其治療功效。因此，Makoto Sakurazawa等人在2000年通過觀察大鼠Bcl-xL的晶體結構，定點突變Bcl-xL的3個氨基酸(22位酪氨酸突變為苯丙氨酸(F)、26位谷氨酰胺突變為天冬酰胺(N)、165位的精氨酸突變為賴氨酸(K)，構建了超級抗凋亡因子FNK(最初命名bcl-x FNK)，成為哺乳類動物凋亡因子中首個也是唯一的功能增強型突變體。將FNK的cDNA轉染細胞，能保護各種刺激，包括氧化應激(過氧化氫和百草枯)、Ca²⁺載體(A23187)、生長因子缺失(血清和IL-3)、Fas抗體、細胞周期抑制劑(TN-16、喜樹堿、羥基脲、曲古菌素A)、蛋白激酶抑制劑(星孢菌素)及熱應激等引起的細胞死亡。PTD(Protein transduction domain)是由幾個堿基組成的結構域，能夠介導外源蛋白穿透細胞膜，迅速到達作用部位。1988年，Green和Frankel分別發現了從HIV-I病毒中分離出的Tat蛋白可以自主地穿越細胞膜進入細胞，首次報道了蛋白轉導的現象，其核心序列PTD由11個氨基酸組成，PTD的序列為YGRKKRRQRRR，蛋白轉導具有轉導速度快、轉運過程不需要能量和光譜性等特點。因此，將FNK與PTD融合后的PTD-FNK蛋白，能快速進入細胞，提高了FNK蛋白的功效。因此一種簡便的PTD-FNK蛋白提取方式成為一種需求。

PTD-Bcl-xL蛋白功能增強型突變體PTD-FNK蛋白在保護細胞抵抗外界不利因素(低溫，凋亡誘導劑、缺血清等)刺激方面有著顯著的作用，目前PTD-FNK蛋白的原核表達形式為包涵體，需要經過復性過程，獲取可溶性蛋白，且蛋白在復性過程損耗極大，嚴重限制了蛋白的大量生產，阻礙了蛋白在生產實踐中的應用進程。

發明內容

本發明的目的是解決上述現有技術中存在的不足之處，通過優化蛋白表達的最優條件，大量誘導蛋白表達并且進行純化，提供一種抗凋亡蛋白PTD-FNK蛋白及其制備方法。

本發明的目的是這樣實現的：以大鼠肝臟總RNA為模板，通過分子克隆技術及基因點突變技術，構建PTD-FNK蛋白的原核表達載體pET28a(+)-PTD-FNK質粒，并將其轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中低溫誘導PTD-FNK的可溶性表達并分別從上清和沉淀中提取蛋白。

一種抗凋亡蛋白PTD-FNK蛋白，該蛋白質為抗凋亡蛋白Bcl-xL的突變體并添加膜穿梭序列PTD，其分子量為36kDa，其序列為：