[發明專利]轉日本晴水稻OsNramp5基因的重金屬超富集轉基因工程水稻的創制及應用

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• 申請號: 201810093347.3
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108315348A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 羅顏榮;陳坤明;袁博;吳兆鋒;李永輝;魏偉;劉捷;白帆
• 申請（專利權）人: 廣東開源環境科技有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46;B09C1/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

本發明公開一種轉日本晴水稻OsNramp5基因的重金屬超富集轉基因工程水稻的創制，包括：克隆水稻中OsNramp5基因；以植物表達載體為基礎，構建包含強啟動子、篩選基因的轉化載體，將所述OsNramp5基因通過同源重組方法插入所述轉化載體，獲得超量表達雙元載體；將所得超量表達雙元載體通過根癌農桿菌轉入水稻愈傷組織中，培育轉基因苗并篩選轉基因陽性植株；其中，轉基因受體植株為水稻日本晴品種。本發明提供的培育方法可解決野生重金屬富集植株耐性有限、成長緩慢、生物量小、生長環境特殊以及重金屬重返等問題。此外，本發明還提供一種轉日本晴水稻OsNramp5基因的重金屬超富集轉基因工程水稻的創制中所得的重金屬超富集轉基因植株在土壤重金屬修復中的應用。

技術領域

本發明屬于轉基因植株和重金屬污染治理領域，具體涉及轉日本晴水稻OsNramp5基因的重金屬超富集轉基因工程水稻的創制及應用。

背景技術

重金屬污染問題已成為一個世界性重大環境問題，重金屬污染不僅威脅動植物、微生物生產發育，還通過食物鏈等威脅人類健康乃至生命。導致土壤污染的重金屬主要有As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg等，一般為幾種重金屬的復合污染。重金屬礦區、經濟高速發展區的重金屬污染情況尤為嚴重，導致我國許多農產品由于重金屬超標而被拒絕進入國際市場。

各國對重金屬污染的生態效應和防治的研究越來越重視，已探索出多種治理技術。然而傳統的重金屬污染技術如土壤固化、玻璃化、淋濾化、洗土法、客土法、電化學法等物理化學方法，不僅成本高昂，難以大規模使用，而且常常導致土壤結構破壞、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，尋求一種廉價而永久有效，又可以維持土壤肥力的替換方法一直是國際上研究的難點和熱點。

利用綠色植物清除污染物的策略，即植物修復技術具有成本低，環境友好和可再利用等特點，是一種非常有前景的環境污染原位治理途徑。廣義的植物修復指通過植物萃取、轉化、固定、揮發、降解作用將土壤及水體中有機污染物、重金屬等污染物清除的過程。通過種植具有重金屬富集能力的植物，將植物收割并妥善處理(如灰化等)，以到達將重金屬移出土壤環境，清除土壤重金屬污染的目的。

基因是決定植物對土壤重金屬吸收積累特性的最重要因素，重金屬富集植物耐重金屬的機制主要包括三個方面，第一，排斥機制，阻礙重金屬的吸收或體內運輸，吸收后又排出體外；第二，局域化機制，使重金屬在植物的液泡、表皮毛、細胞壁等特定部位積累，從而與細胞中的其他組分隔離，達到解毒的效果；第三，絡合機制，植物體內物質與重金屬絡合，包括與無機物絡合形成硫化物，與小分子有機物如GSH、草酸、組氨酸和檸檬酸等絡合后在液泡中聚集，與大分子的金屬鏊合蛋白絡合。但目前，野生重金屬富集植株存在耐性有限、成長緩慢、生物量小、生長環境特殊、以及重金屬重返等問題。基因工程技術是目前土壤重金屬修復研究中最具前景的高新生物技術，因此，將植物的重金屬超富集基因克隆并轉移到生物量大、生產迅速的植物上以提高植物修復的能力，是解決土壤重金屬污染問題的有效方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種轉日本晴水稻OsNramp5基因的重金屬超富集轉基因工程水稻的創制及應用，解決野生重金屬富集植株存在耐性有限、成長緩慢、生物量小、生長環境特殊、以及重金屬重返等問題。

為實現上述目的，本發明提供一種轉日本晴水稻OsNramp5基因的重金屬超富集轉基因工程水稻的創制，具體指重金屬超富集轉基因工程水稻的構建方法，包括：

(1)重金屬超富集基因的克隆，克隆水稻中OsNramp5基因。研究結果表明，OsNramp5蛋白對鎘、錳等重金屬離子具有較強的吸附能力，是水稻富集鎘等重金屬的關鍵基因，過量表達該基因能夠顯著提高水稻對鎘等重金屬的吸附能力；

(2)超量表達雙元載體的構建，以植物表達載體為基礎，構建包含強啟動子、篩選基因的轉化載體，將驟(1)克隆得到的OsNramp5基因通過同源重組方法插入所述轉化載體，獲得超量表達雙元載體；