[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810092469.0
• 申請(qǐng)日: 2018-01-30
• 公開（公告）號(hào): CN108192914A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅顏榮;陳坤明;袁博;李永輝;吳兆鋒;魏偉;劉捷;白帆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安澤睿環(huán)境科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/20;B09C1/10
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

1.一種轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，包括：

(1)重金屬超富集基因的克隆

克隆伴礦景天中SpNramp5基因；

(2)超量表達(dá)雙元載體的構(gòu)建

以植物表達(dá)載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建包含強(qiáng)啟動(dòng)子、篩選基因的轉(zhuǎn)化載體，將步驟(1)克隆得到的SpNramp5基因通過(guò)同源重組方法插入所述轉(zhuǎn)化載體，獲得超量表達(dá)雙元載體；

(3)重金屬超富集轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建

將步驟(2)所得的超量表達(dá)雙元載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入油菜下胚軸切段中，用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得的轉(zhuǎn)基因抗性油菜下胚軸切段經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)、分化、生根、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選重金屬超富集轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；

其中，所述SpNramp5基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述油菜品種為甘藍(lán)型油菜K407。

2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，所述步驟(1)中，克隆伴礦景天中SpNramp5基因的方法為：

以伴礦景天的cDNA為模板，以如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SpNramp5基因。

3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301載體，所述強(qiáng)啟動(dòng)子為Ubiquitin啟動(dòng)子，所述篩選基因?yàn)锽ar篩選基因，所述轉(zhuǎn)化載體還包括3×Flag標(biāo)簽。

4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：

(a)在所述pCAMBIA1301載體多克隆位點(diǎn)Kpn I和Sac I之間添加所述3×Flag標(biāo)簽；

(b)采用PCR擴(kuò)增反應(yīng)克隆所述pCAMBIA3301載體上的所述Bar篩選基因；

(c)使用內(nèi)切酶Xho I酶切步驟(a)中獲得的載體，并將所述Bar篩選基因與酶切后的載體進(jìn)行同源重組；

(d)采用Hind III和BamH I酶切pUN1301載體上的Ubiquitin啟動(dòng)子；

(e)使用內(nèi)切酶Hind III和BamH I酶切步驟(c)中獲得的重組載體，并將所述Ubiquitin啟動(dòng)子與酶切后的重組載體連接。

5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，所述Ubiquitin啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述Bar篩選基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述3×Flag標(biāo)簽的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

6.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，步驟(b)中，所述克隆pCAMBIA3301載體上的所述Bar篩選基因的PCR引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

7.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，所述篩選培養(yǎng)基包含草銨膦。

8.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)伴礦景天SpNramp5基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，其特征在于，所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301載體，所述強(qiáng)啟動(dòng)子為2×CaMV35S啟動(dòng)子，所述篩選基因?yàn)镠YG篩選基因。