[發明專利]收獲細胞的方法和系統

在審

• 申請號: 201810092359.4
• 申請日: 2012-04-15
• 公開（公告）號: CN108342350A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: H·庫索托;N·德羅里-卡米;B·佐哈爾
• 申請（專利權）人: 普拉里斯坦有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/071;C12N5/073;C12N5/0775;C12M1/00;C12M1/12;C12M1/26
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 袁泉

本發明提供了使用振動收獲在3D培養物中生長的細胞的方法。所述方法對附著于3D基質的細胞施加足夠振幅、頻率和持續時間，使得細胞與基質分離并使分離的細胞從基質材料中沖掉(flush)。本發明還提供了進行本發明方法的裝置。

本申請是申請日為2012年4月15日、申請號為201280018602.9、發明名稱為“收獲細胞的方法和系統”的發明專利申請的分案申請。

相關申請的交叉參考

本申請要求2011年4月15日申請的美國臨時申請號的優先權，所述申請全文并入本文。

發明領域

本發明涉及收獲培養生長的細胞的方法和系統。更特別地，本發明涉及收獲在三維(3D)培養基上體外生長的細胞的方法和系統，通過施加足夠頻率、振幅和持續時間的振動力，使細胞從3D基質中釋放，由此細胞以高收率和高細胞存活率和活力(vitality)回收。所述振動力也可用于將細胞接種在基質上，之后生長，及用于細胞在3D生物反應器系統中生長期間與3D基質有效混合。

細胞、如哺乳動物或人細胞群，在醫學中作為可用于治療許多不同醫學病癥的生物制劑而越來越重要。例如，已經相當感興趣地關注于人細胞在各種醫學應用方面的治療潛力，包括損傷器官如腦、心臟、骨和肝臟的組織修復，及支持骨髓移植(BMT)。已經對一類人細胞-成人干細胞-在治療和治愈各種病癥如造血功能失調、心臟病、帕金森氏癥、阿爾茲海默病、腦卒中、燒傷、肌肉萎縮癥、自身免疫失調、糖尿病和關節炎中的作用進行了評估。

另一類感興趣的人細胞是粘附基質細胞(ASC)。ASC是異質細胞群，可得自骨髓、脂肪組織、胎盤或者血液。ASC及其在體外增殖造血干細胞中的應用在美國專利No.6,911,201中描述，所述專利以其全部內容并入本文。

由于其在臨床和研究領域中的不同醫學應用，越來越需要大規模的ASC。使用這些細胞的障礙在于由于這些細胞在大多數組織中的有限數量而導致的分離大量正常存在的粘附基質細胞群的技術難題，以及獲得ASC的方法中包含的不適和風險。

一種解決ASC有限數目難題的方案是在3D培養系統中在使得細胞擴增的條件下體外培養細胞。以其全部內容并入本文的WO 2007/108003揭示了在3D生物反應器中通過培養擴增ASC的方法，及所述細胞在治療中的應用。通過在3D基質中體外培養而擴增ASC也在WO2010/026575中揭示，所述文獻以其全部內容并入本文。在這些參考文獻中，ASC在3D基質中生長之后，細胞用如下程序收獲，用緩沖液多次洗滌細胞和基質及隨后通過將細胞暴露于胰蛋白酶EDTA溶液輕輕攪拌而將細胞從基質中釋放出來。

雖然在這些參考文獻中描述的收獲方法使得可以從3D基質中回收擴增的ASC，但是基質的特性導致所述方法的低效。3D基質的優勢是其提供了三維微環境，在其中培養的細胞能更好地模擬其體內對應物。雖然基質中3D微環境促進培養的細胞的生長和增殖，但是其也提供了內部空間，難以在收獲方法中從中移出細胞。這個難題由于存在由培養的細胞分泌的胞外大分子使細胞附著于基質表面而復雜化。

因此，需要改良從生物反應器中使用的3D基質中有效回收細胞的細胞收獲方法。

發明概述

根據一方面，本發明提供了收獲在培養物中生長的細胞的方法，包括使細胞在粘附材料上生長，其中細胞附著于所述粘附材料，通過將細胞暴露于解離劑而將其與粘附材料解離，以足以使細胞從粘附材料中釋放的頻率和振幅振動所述粘附材料一段時間，并回收細胞。在一些實施方案中，所述方法進一步包括以足以將釋放的細胞從粘附材料中沖掉(flush)的頻率和振幅振動所述粘附材料一段時間。在進一步的實施方案中，所述粘附材料提供細胞附著的二維表面，而在其它實施方案中，粘附材料提供細胞附著的三維基質。