[發明專利]一種鮑魚血細胞抗凝保護劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201810092352.2
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN107988140B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 李明珠;孔瑤瑤;楊熙蕓;姚傳偉;李浩宇;孟曉雪;劉明芳;阮澤立;李圣強;畢秀娟;時心澤;潘世杰
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 楊樂

本發明公開了一種鮑魚血細胞抗凝保護劑及其制備方法，所述抗凝保護劑由以下成分組成：氯化鈉2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4?哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。采用本發明的鮑魚血細胞抗凝保護劑可保證鮑魚血細胞在較長時間內不發生凝集且維持較高的存活率，解決了鮑魚血細胞離體后短時間內凝集成團的問題，為研究鮑魚非特異性免疫能力奠定基礎。

技術領域

本發明涉及血細胞抗凝保護劑技術領域，具體涉及一種鮑魚血細胞抗凝保護劑及其制備方法。

背景技術

鮑魚由于營養豐富，經濟價值高，成為我國重要的海水養殖品種。近年來，鮑魚養殖遭受病害困擾，產量受到顯著影響。針對鮑魚非特異性免疫能力的研究成為解決鮑魚病害問題的關鍵要素之一。鮑魚主要通過血細胞對病原微生物的吞噬作用來實現基本的防御功能，因此對鮑血細胞的研究是探索非特異性免疫的重要環節。在不加抗凝保護劑的情況下，鮑魚血細胞一旦離體，幾分鐘內即大量凝集。即便加入某些抗凝保護劑的鮑魚血細胞在短時間內也會大量死亡，這個特點嚴重阻礙了我們對鮑魚血細胞進行生化、免疫和分子生物學方面的研究。因此，開發在一定時間內可以防止鮑魚血細胞凝集并保持細胞活性的抗凝保護劑是研究鮑魚非特異性免疫能力的基礎。

目前應用于鮑魚血細胞的抗凝保護劑有滅菌海水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Tris鹽緩沖液(TBS)、哺乳動物血細胞的抗凝保護劑和其他貝類(牡蠣和扇貝)血細胞的抗凝保護劑等。應用效果上，滅菌海水、PBS和TBS并不適合，鮑魚血細胞在短時間內就會發生大量凝集，并且血細胞的吞噬活性顯著受到抑制。應用改良的哺乳動物血細胞保存液(modifiedAlserver’s solution，MAS)，即MAS抗凝保護劑，可以短暫保存疣鮑和牡蠣血細胞，但其抗凝效果并不清楚。應用牡蠣和扇貝抗凝保護劑可以得到不錯的抗凝效果，但是抗凝時間不能持續很久。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鮑魚血細胞抗凝保護劑，用以解決現有技術中鮑魚血細胞離體后短時間內大量凝集的問題。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種鮑魚血細胞抗凝保護劑，由以下成分組成：氯化鈉2.45～2.55g、EDTA 0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。

優選地，所述抗凝保護劑由以下成分組成：氯化鈉2.5g、EDTA 1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mM PBS 100ml。

本發明還公開了上述鮑魚血細胞抗凝保護劑的制備方法，具體包括如下步驟：

(1)取0.1mM PBS緩沖液倒入燒杯中，再向燒杯中加入固體氯化鈉粉末攪拌3-5分鐘，直到氯化鈉全部溶解，然后，加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分攪拌溶解得混合溶液A；

(2)然后將混合溶液A放入38-40℃水浴鍋中加熱，再緩慢加入EDTA，邊加入邊攪拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；

(3)將混合溶液B轉到室溫狀態下用磁力攪拌器攪拌0.5-1h，使各組分充分溶解到PBS緩沖液中；

(4)超凈工作臺開啟紫外殺菌功能30-35min，然后在超凈工作臺上將混合溶液B先用0.45um無菌濾器過濾除雜放入滅菌藍蓋瓶中，再用0.22um無菌濾器將藍蓋瓶中液體過濾除菌，然后得到的鮑魚血細胞抗凝保護劑(記為AP)。

優選地，上述鮑魚血細胞抗凝保護劑的制備方法中，所述步驟(2)中水浴鍋加熱溫度為40℃。

優選地，上述鮑魚血細胞抗凝保護劑的制備方法中，所述步驟(3)中磁力攪拌器攪拌時間為0.5h。

上述鮑魚血細胞抗凝保護劑可在4℃或室溫條件下，保存于滅菌藍蓋瓶中備用。

本發明方法具有如下優點：