[發明專利]用于昆蟲表達系統分泌表達的導肽

有效

• 申請號: 201810091875.5
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108409838B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 聶作明;斯洪強;盛清
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/85;C12N15/86
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種家蠶蛋白30K2及其編碼該蛋白的導肽；本發明還同時公開了上述家蠶蛋白30K2導肽的用途：在細胞(昆蟲細胞)中引導蛋白分泌到胞外。本發明將蛋白引導進入分泌蛋白途徑，進而使蛋白分泌到胞外：其作用是能夠利用家蠶蛋白30K2導肽來構建昆蟲真核表達載體、桿狀病毒載體系統及穩轉細胞的質粒，使其載體上構建的蛋白能夠在表達出來之后直接分泌到胞外培養液中，可通過細胞穩轉和連續流動培養系統，實現蛋白的真核連續表達，同時該導肽能夠在分泌完成之后將自身剪切掉，從而不影響需要表達蛋白的構象及功能。本發明鑒定了30K2導肽引導重組蛋白分泌至胞外培養基中。

技術領域

本發明屬于生物技術和醫藥生產領域，涉及家蠶細胞內一條可引導表達蛋白質分泌到胞外的導肽，該導肽可應用于昆蟲細胞分泌活性蛋白研究的技術領域和生產領域。

背景技術

昆蟲細胞表達系統是目前四大表達系統(昆蟲細胞、細菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統)之一。細菌等原核表達系統表達蛋白量雖然很高，但不能對表達的蛋白進行翻譯后加工修飾，往往不具有生物活性，真核表達系統表達產物翻譯后修飾完備，廣泛應用于科研和生物制藥行業活性蛋白的表達。在真核表達系統中，酵母表達系統表達的蛋白易降解，而哺乳動物細胞表達系統表達的蛋白成本高。昆蟲細胞表達系統作為真核細胞表達系統具有其他兩個真核系統無法相比的優勢：(1)具有完整的蛋白翻譯后加工修飾系統；(2)蛋白折疊正確，重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白；(3)可表達非常大的外源性基因(～200kD)而不至于影響本身的增殖；(4)對脊椎動物，尤其是人類是安全的，桿狀病毒屬于昆蟲病毒，對脊椎動物無致病性，被認為是安全的載體。目前的昆蟲細胞表達系統主要是桿狀病毒表達系統、瞬時表達系統和細胞穩轉表達系統，這些系統表達的蛋白存在于細胞質中，獲取表達的蛋白需要收集細胞，因此其表達量受限于細胞的培養量，導致規模化的表達蛋白成本仍然很高，無法實現昆蟲表達系統的連續流動培養和規?；磉_。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種用于昆蟲表達系統分泌表達的導肽，本發明鑒定了30K2導肽引導重組蛋白分泌至胞外培養基中。

為了解決上述技術問題，本發明提供家蠶蛋白30K2的導肽(用于昆蟲表達系統分泌表達的導肽)，其包含截點的蛋白質氨基酸序列為(三聯子形式)：MKPVIVILCLFVASLYAADSD。

本發明還同時提供了編碼上述蛋白質的導肽序列，編碼該導肽序列的核苷酸序列為：ATGAAGCCCGTCATAGTTATTCTATGTCTTTTCGTGGCATCTCTGTATGCTGCAGATTCCGAC。

本發明還同時公開了上述家蠶蛋白30K2導肽的用途：在細胞(昆蟲細胞)中引導蛋白分泌到胞外。

即，將蛋白引導進入分泌蛋白途徑，進而使蛋白分泌到胞外。其作用是能夠利用家蠶蛋白30K2導肽來構建商業化的昆蟲真核表達載體、桿狀病毒載體系統及穩轉細胞的質粒，使其載體上構建的蛋白能夠在表達出來之后直接分泌到胞外培養液中，可通過細胞穩轉和連續流動培養系統，實現蛋白的真核連續表達，同時該導肽能夠在分泌完成之后將自身剪切掉，從而不影響需要表達蛋白的構象及功能，可用于科學研究和生物制藥行業中重要功能蛋白和藥用蛋白的規?；B續表達。

作為本發明的家蠶蛋白30K2導肽的用途的改進：構建商業化昆蟲真核表達載體或桿狀病毒載體系統用于表達分泌感興趣蛋白或多肽，以及，用于構建穩轉細胞的質粒。

本發明公開了利用上述導肽構建EGFP蛋白的家蠶細胞真核表達載體，進行了EGFP蛋白的分泌表達。

本發明的流程主要分為兩個部分：

1.構建重組載體pIEx-1-Spro-EGFP-myc epitope-6*his；