[發明專利]一種潤腸功能的富硒酵母及其制備方法

在審

• 申請號: 201810091648.2
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108277232A
• 公開（公告）日: 2018-07-13
• 發明（設計）人: 陳俊丞
• 申請（專利權）人: 廣西天昌投資有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/02;C12N15/53;C12N1/19;A61K36/064;A61P1/00;C12R1/865
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 孫文卉

1.一種用于在釀酒酵母中分泌表達超氧化物歧化酶的重組表達載體，是攜帶釀酒酵母MF-α信號肽基因和hCu/Zn-SOD基因的重組釀酒酵母分泌表達載體；用于構建重組釀酒酵母分泌表達載體的出發載體可為任意一種可在釀酒酵母中分泌表達外源基因的真核表達載體，如pJK3、pMD18-T、pUC19、pET22b(+)等，優選為pUC19；以pUC19為出發載體構建的重組釀酒酵母分泌表達載體命名為pUC19-MS。

2.根據權利要求1所述的重組釀酒酵母分泌表達載體，其特征在于：所述重組釀酒酵母分泌表達載體pUC19-MS的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

3.根據權利要求2所述的重組釀酒酵母分泌表達載體，其特征在于：所述重組釀酒酵母分泌表達載體pUC19-MS的構建方法，包括以下步驟：

1)擴增釀酒酵母MF-α信號肽基因：以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株INVSC1的菌體裂解液為模板，在引物T1：5'-GGGGTACCATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGC-3'(含KpnI酶切位點)和T2：5'-CGGGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT-3'(含BamHI酶切位點)的引導下PCR擴增MF-α信號肽基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；

2)擴增hCu/Zn-SOD基因：提取人胃組織總mRNA，然后RT-PCR擴增出其總cDNA作為PCR模板，在引物I1：5'-CGGGATCCGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCT-3'(含BamHI酶切位點)和I2：5'-GCTCTAGAGAATGTTTATTGGGCGATCC-3'(含XbaI酶切位點)的引導下PCR擴增hCu/Zn-SOD基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；

3)構建克隆載體pUC-MS：將釀酒酵母MF-α信號肽基因和hCu/Zn-SOD基因連接入克隆載體pUC19中，得到攜帶釀酒酵母MF-α信號肽基因和hCu/Zn-SOD基因的克隆載體pUC-MS，hCu/Zn-SOD融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

4)構建重組釀酒酵母分泌表達載體：將克隆載體pUC-MS與載體pUC19經KpnI和XbaI進行雙酶切后，將釀酒酵母MF-α信號肽基因和hCu/Zn-SOD基因連接入釀酵母分泌型表達載體pUC19中，得到用于分泌表達hCu/Zn-SOD的重組釀酒酵母分泌表達載體pUC19-MS，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

4.一種可分泌表達超氧化物歧化酶的工程釀酒酵母，是以釀酒酵母轉化有權利要求1-3中任一項所述重組釀酒酵母分泌表達載體，優選pUC19-MS，得到的重組釀酒酵母；所述釀酒酵母為適于蛋白表達的釀酒酵母菌株，如INVSC1；所述轉化方法為醋酸鋰法、熱激法、電轉化法、接合轉化法PEG介導的原生質體轉化法等；以INVSC1為出發菌株，構建的轉化有重組釀酒酵母分泌表達載體pUC19-MS的工程釀酒酵母為pUC19-MS/INVSC1。

5.一種在釀酒酵母中分泌表達超氧化物歧化酶的方法，包括在培養基中發酵權利要求4所述工程釀酒酵母，得到高活性的超氧化物歧化酶的過程。

6.根據權利要求5所述的分泌表達方法，其特征在于：所述培養基為YPD半乳糖誘導培養基，是由以下組分組成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的濃度為20g/L；所述發酵溫度為30℃，誘導時間為24-48小時。

7.權利要求4所述工程釀酒酵母在制備用于潤腸產品中的SOD活性基質中的應用。

8.一種SOD活性基質，將權利要求4所述工程釀酒酵母(例如pUC19-MS/INVSC1)在YPD半乳糖誘導培養基里進行30℃培養，在該釀酒酵母生長至對數期(約16-18h，OD:1.3-1.5)，經Westernblot驗證SOD表達，得到SOD活性基質；所述YPD半乳糖誘導培養基為由以下組分組成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的濃度為20g/L。