[發明專利]一種編碼蛋白Pm_MF的鑒定方法和應用

在審

• 申請號: 201810091103.1
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108330141A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 姜巨全;韓波;張瑞;張正來;徐桐;孟琳;鄒俏;鄭秀桃
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12Q1/686;C12N1/21;G01N33/68;C12Q1/04;C05G3/04;C05G3/00
• 代理公司: 成都環泰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 51242
• 代理人: 鄒翠;李斌

1.一種編碼蛋白Pm_MF的鑒定方法，其特征在于，所述編碼蛋白Pm_MF的鑒定方法應用蛋白Pm_MF；所述蛋白Pm_MF具有Na⁺(Li⁺、K⁺)/H⁺逆向轉運蛋白活性，所述活性具有pH依賴性；

所述蛋白Pm_MF還具有多藥物外排活性，用于藥物EB和諾氟沙星的輸出。

2.如權利要求1所述編碼蛋白Pm_MF的鑒定方法，其特征在于，所述編碼蛋白Pm_MF的鑒定方法包括以下步驟：

1)通過基因文庫和功能互補相結合的方法，以0.2M NaCl的氨芐抗性固體培養基作為篩選工具，得到含有耐鹽堿基因的片段；

2)利用生物信息學軟件對基因片段進行分析，確定耐鹽堿的基因，通過PCR擴增得到Pm_mf基因，所述Pm_mf基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；構建含有Pm_mf基因的原核表達載體；

3)通過基因功能互補的方法，對Pm_mf基因的生理功能進行鑒定；

4)通過Western Blot實驗，對預測為膜蛋白的蛋白Pm_MF進行細胞定位鑒定；

5)再通過熒光猝滅技術手段，對Pm_MF蛋白功能進行鑒定，Pm_MF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2；

步驟4)中，Western Blot細胞定位方法包括：利用超離法將KNabc/pET-Pm_mf細胞的胞漿蛋白與膜蛋白分離開，再通過蛋白印跡雜交Western Blot的方法，分別對提取的細胞全蛋白、胞漿蛋白和膜蛋白進行檢測；

步驟5)中，所述熒光猝滅技術手段，包括：以吖啶橙AO作為熒光探針，檢測熒光猝滅及恢復情況；向盛2.5mL緩沖液B的石英杯中加入2μM熒光探針吖啶橙AO和40μg的反轉膜，抽吸混勻；再加入終濃度為5mM的Tris-D-乳酸并混勻反應體液；乳酸作為底物，通過呼吸鏈產生跨膜pH梯度ΔpH，此時熒光強度已開始下降；利用熒光分光光度計來監控跨膜pH梯度的變化；

熒光監控參數設置：激發光EX波長492nm，發射光(EM波長526nm；當熒光強度下降至穩定狀態時，向反應體系加入終濃度為5mM的NaCl、KCl、LiCl，以破壞pH梯度ΔpH，此時熒光強度開始升高；根據熒光強度的恢復程度判斷并表示Na⁺(Li⁺，K⁺)/H⁺逆向轉運蛋白活性的有無及大小；

所述構建含有Pm_mf基因的原核表達載體包括構建pET-Pm_mf原核表達載體，構建方法包括：

根據Pm_mf基因序列，首先利用Primer5軟件設計特性引物Pm_mf-F與Pm_mf-R特異引物，并在基因的5’和3’端分別引入Nde I、BamH I兩個酶切位點，然后進行Pm_mf的PCR擴增；

將PCR擴增產物末端加“A”后連入pEASY-T3載體，然后化轉到Trans1-T1感受態細胞中，進行藍白斑篩選出亞克隆；再用Nde I、BamH I兩種內切酶處理重組質粒pEASY-Pm_mf，并同時對pET19b原核表達載體做相同處理，對處理后的pET19b和Pm_mf片段進行回收并連接，通過熱激法將構建好的表達載體pET-Pm_mf導入異源表達宿主E.coli KNabc中。其具體方法如下：

取E.coli KNabc感受態細胞，向其中加入適量的pET-Pm_mf重組質粒，輕輕混勻，冰浴30min；然后將盛有上述混合物的離心管至于42℃水浴中熱激90s；之后快速移至冰浴，放置10min；再將入37℃預熱的新鮮培養基進行復蘇45min；最后，取適當體積均勻涂布在含有氨芐抗性的LBK培養基上。

3.一種利用權利要求1所述編碼蛋白Pm_MF的鑒定方法構建的用于鑒定蛋白Pm_MF具有的多藥物外排功能的大腸桿菌DH5αacrAacrB基因敲除突變株。