[發(fā)明專利]一種以兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810087572.6
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108486093B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫彥;張春玉;余林玲;董曉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N11/089
• 分類號: C12N11/089;C12N11/14;C12N9/20;C08G83/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種以兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶；其結(jié)構(gòu)式如下：

其中酶

二氧化硅納米粒子；

固定化酶為皺褶假絲酵母脂肪酶。

2.權(quán)利要求1的兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶的制備方法，其特征是步驟如下：

1)兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)的制備方法：將聚(馬來酸酐-alt-1-十八碳烯)(MAO)與N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的開環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物p(MAO-DMEA)接枝到二氧化硅納米粒子表面，得到兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)SNPs-p(MAO-DMEA)；

2)以兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶的制備方法：以SNPs-p(MAO-DMEA)為載體，通過表面羧基的活化，將酶與載體共價結(jié)合，制得以兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶；活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)；

兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)的制備方法步驟如下：

(1)以四氫呋喃為溶劑，以聚(馬來酸酐-alt-1-十八碳烯)和N，N-二甲基乙二胺為原料，通過二者的開環(huán)反應(yīng)合成兩性離子聚合物p(MAO-DMEA)；

(2)利用氨丙基三乙氧基硅烷處理平均粒徑為20-30nm的二氧化硅納米粒子，得到氨基化的二氧化硅納米粒子SNPs-NH₂；將p(MAO-DMEA)溶解在氯仿溶液中，配成濃度為17.5-75mg/mL的溶液，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，DCC和NHS的濃度分別為12.5-53mg/mL和7.02-29.6mg/mL，對p(MAO-DMEA)表面羧基進行活化，然后加入上述氨基化的二氧化硅納米粒子SNPs-NH₂，置于20-30℃的恒溫水浴搖床中振蕩，反應(yīng)結(jié)束后離心分離并依次用DMF、乙醇、去離子水清洗，得到兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)SNPs-p(MAO-DMEA)；結(jié)構(gòu)式如下：

所述p(MAO-DMEA)與納米粒子的質(zhì)量比為0.71～2.88:1；所述步驟(2)中所述的活化時間為1-2h；所述步驟(2)水浴搖床振蕩是以120-200rpm震蕩12-20h；離心速率是8000-10000rpm。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述步驟2)以兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶的制備方法，其步驟如下

1)將兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)加入到MES緩沖液中，配成濃度為22-29mg/mL的懸浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，使得懸浮液中EDC和NHS的濃度分別為40-60mg/mL和12-18mg/mL，室溫下振蕩反應(yīng)，活化后離心棄上清并用磷酸緩沖液對活化的納米介質(zhì)進行清洗以除去未反應(yīng)的EDC、NHS及副產(chǎn)物，得到活化后的兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)；

2)將目標(biāo)酶溶解于磷酸緩沖液中，高速冷凍離心收集上層酶溶液，除去不溶物，得到目標(biāo)酶溶液；

3)將步驟1)中活化后的兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)加入到磷酸緩沖液中，再與目標(biāo)酶溶液混合，使懸浮液中目標(biāo)酶蛋白的濃度為0.09-0.89mg/mL，然后置于4-10℃恒溫空氣浴搖床中振蕩反應(yīng)，使目標(biāo)酶固定在兩性離子聚合物改性載體上，反應(yīng)結(jié)束后洗滌、8000-9000rpm冷凍離心，得到以兩性離子聚合物接枝納米介質(zhì)為載體的固定化酶；

所述步驟1)中室溫下振蕩反應(yīng)30-60min；離心速率為8000-9000rpm；所述步驟3)中空氣浴搖床中振蕩條件為：速率是100-170rpm下反應(yīng)10-20h。