[發(fā)明專利]一種痕量絲素蛋白富集方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810086592.1
• 申請(qǐng)日: 2018-01-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108387435B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴賢君;鄭海玲;馬超;周揚(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量大學(xué);中國(guó)絲綢博物館
• 主分類號(hào): G01N1/40
• 分類號(hào): G01N1/40;G01N33/68
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種痕量絲素蛋白富集方法，其特征在于包括以下步驟：

1）不同絲素蛋白單克隆抗體的混合：取自鼠的重鏈分別為IgG1、IgG2b、IgA的三種絲素蛋白單克隆抗體同質(zhì)量濃度混合；

2）耦聯(lián)反應(yīng)：取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH為6.0、濃度為15mmol/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中，然后加入步驟1）中制備的混合抗體70μg，置于振蕩器上室溫耦聯(lián)反應(yīng)過(guò)夜；

3）免疫磁珠的獲得：用磁力架收集步驟2）中耦聯(lián)反應(yīng)后的磁珠并去除上清液，得到重鏈分別為IgG1、IgG2b、IgA的絲素蛋白單克隆抗體免疫磁珠；

4）鑒定：另取1mg未耦聯(lián)的磁珠和步驟3）中耦聯(lián)后的磁珠在55-65℃下烘干，進(jìn)行傅里葉紅外檢測(cè)，觀察1541cm^-1處的特征峰，確定耦聯(lián)狀態(tài)；

5）耦聯(lián)后免疫磁珠的絲素蛋白單克隆抗體固定化：在步驟3）中得到的絲素蛋白單克隆抗體免疫磁珠中加入1ml新鮮配制的濃度為0.2mol/L、PH為8.2的三乙醇胺溶液，三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的鄰苯二甲酸二甲酯，混合后的溶液置于振蕩器上以保證磁珠處于懸浮狀態(tài)，在室溫孵育30min；孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接著用1mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌交聯(lián)后的磁珠2-4次，然后再用1mL的磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌磁珠1-3遍，最后用1mL含0.02% NaN₃、0.1%牛血清蛋白的磷酸緩沖鹽溶液重懸磁珠，并保存于4℃冰箱；

6）絲素蛋白單克隆抗體免疫磁珠與絲素蛋白的結(jié)合：把步驟5）最終得到的免疫磁珠置于振蕩器上以保證磁珠處于懸浮狀態(tài)，在常溫下孵育1h；每毫升免疫磁珠中加入含有10～100ng的絲素蛋白樣品，置于振蕩器上以保證磁珠處于懸浮狀態(tài),并在25℃反應(yīng)60min；然后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接著用1mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌交聯(lián)后的磁珠3次；

7）絲素蛋白的洗脫：加入100uL洗脫溶液與步驟6）得到的磁珠混勻，洗脫溶液是甘氨酸，濃度為0.1mol/L、PH為2，把磁珠置于振蕩器上以保證磁珠處于懸浮狀態(tài)，在室溫孵育10min；然后用磁力架收集磁珠，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)小管中，重復(fù)一次收集洗脫液；

8）檢測(cè)：合并步驟7）中的洗脫液，并用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)整pH為7后進(jìn)行ELISA檢測(cè)；

9）加標(biāo)回收：在10～100ng絲素蛋白添加到每mL免疫磁珠中時(shí)，絲素蛋白的富集效率達(dá)到80%以上。