[發(fā)明專利]一種庫蠓近緣種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列及其分子鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810084450.1
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108034733B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 侯曉暉;岑常活;段琛
• 申請（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/53;C12N15/11
• 代理公司: 遵義市岡鴻專利代理事務(wù)所(普通合伙) 52102
• 代理人: 陳源鴻

本發(fā)明公開一種庫蠓近緣種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列及其分子鑒定方法，其特征在于采用分子生物學(xué)DNA測序的方法獲取長喙庫蠓、新竹庫蠓和白帶庫蠓等庫蠓近緣種的COⅠ基因序列，再通過基因序列相似性比對，從而根據(jù)比對結(jié)果對該庫蠓近緣種進(jìn)行種類鑒定。本發(fā)明提供的長喙庫蠓、新竹庫蠓和白帶庫蠓等庫蠓近緣種的分子鑒定方法，有利于實現(xiàn)上述三種庫蠓的快速、準(zhǔn)確的鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及昆蟲物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及長喙庫蠓、新竹庫蠓和白帶庫蠓等庫蠓近緣種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列及其分子鑒定方法。

背景技術(shù)

庫蠓（Culicoides Latreille, 1809）隸屬于昆蟲綱（Insecta）雙翅目（diptera）蠓科（Ceratopogonidae），其體型微小、種類繁多、分布廣泛，在全世界現(xiàn)有1368種、中國已知347種，并且在世界范圍內(nèi)還在不斷發(fā)現(xiàn)新物種。吸血蠓是指能通過刺吸反芻動物血液來傳播蟲媒病原體的蠓，包括庫蠓屬Culicoides、蠛蠓屬Lasiohelea、細(xì)蠓屬Leptoconops和澳蠓屬Austroconops等。在庫蠓屬吸血蠓中，通過蠓媒傳播的病原體有藍(lán)舌病病毒(BTV)、家畜流行性出血熱病毒（EHDV）、施馬倫貝格病毒（SBV）、非洲馬瘟病毒（AHSV）等諸多病原體。吸血蠓是家畜流行病傳播過程中的重要一環(huán)，若控制不好將爆發(fā)流行并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，故與醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域息息相關(guān)。因此，準(zhǔn)確鑒定疾病媒介是對蠓傳疾病進(jìn)行監(jiān)測、防治的關(guān)鍵一步。

目前，蠓的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法首先是以完整的成蟲為研究對象，其易受蠓性別和發(fā)育階段的限制導(dǎo)致分類鑒定困難，如蠓卵、幼蟲和蛹等早期階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)和肢體殘缺的蟲體均難以辯認(rèn)且其僅對雄性非吸血蠓蟲有較高的適用性，而針對雌性媒介吸血蠓卻效果不佳。再者，其還存在操作繁瑣、專業(yè)性強(qiáng)等不足之處。最后，蠓的表型可塑性和遺傳可變性也容易導(dǎo)致誤判，尤其是近緣、近似種的分類鑒定。長喙庫蠓、新竹庫蠓和白帶庫蠓等均屬二囊亞屬的近緣種，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定極其困難。因此，亟需尋求一種快速、準(zhǔn)確的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法的不足。

隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，以DNA序列分析為依據(jù)的分子鑒定已成為物種鑒定的常用技術(shù)手段，極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定的缺陷。DNA條形碼技術(shù)是指生物體內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異和一定保守性的、且相對較短易擴(kuò)增的DNA片段。因此，作為DNA 條形碼的標(biāo)準(zhǔn)目的基因，其必須滿足兩個條件，一是必須具有一定的保守性，便于通用引物設(shè)計及進(jìn)行大范圍的PCR擴(kuò)增；二是要有足夠的變異性，以區(qū)分不同物種，尤其是近緣種。

昆蟲線粒體DNA為雙鏈閉環(huán)分子，由ND1-6、ND4L、CO I-CO III、ATPase6、ATPase8、Cytb等13個蛋白質(zhì)基因、22個tRNA基因和2個rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）共37個基因和包含復(fù)制啟動子的非編碼區(qū)段組成。線粒體基因中 CO I、CO II、Cytb、12S rRNA、16SrRNA、ND4、ND5是目前應(yīng)用頻率較多的分子標(biāo)記，其中12S rRNA和16S rRNA因其存在大量的插入和缺失現(xiàn)象且基因高度保守、進(jìn)化較慢，故不宜用做條形編碼基因；ND4和ND5進(jìn)化太快，難以設(shè)計出通用引物，限制了它們作為全面DNA 鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因。相較于其他基因，CO I基因大小和結(jié)構(gòu)較為保守，包含信息量大，能夠保證足夠變異的同時又容易被通用引物擴(kuò)增，在物種內(nèi)不同個體之間只有1%-2%的差異，而近緣種間的差異大，且具有較多的系統(tǒng)發(fā)育信號，更適合解析親緣關(guān)系密切的生物類群，是使用最廣泛的分子標(biāo)記。