[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鑒定及應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810082121.3 | 申請日： | 2018-01-29 |
| 公開（公告）號： | CN108384800B | 公開（公告）日： | 2019-10-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 毛洪玉;延昕;劉迪;祝朋芳;熊超明;畢蒙蒙 | 申請（專利權(quán)）人： | 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/14;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101 | 代理人： | 張述學(xué) |
| 地址： | 110866 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 基因 轉(zhuǎn)基因植株 切花菊 菊花 培育 抗病性 分子植物育種 植物表達載體 植物基因工程 銹病 基因組DNA 轉(zhuǎn)錄 重組載體 轉(zhuǎn)化細胞 轉(zhuǎn)化植株 農(nóng)桿菌 葉盤法 構(gòu)建 介導(dǎo) 整合 抗病 應(yīng)用 克隆 新品種 檢測 轉(zhuǎn)化 | ||
1.一種轉(zhuǎn)CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法，其特征在于：以菊花白色銹病高抗品種‘雙粉匙’為材料獲得抗病基因CmWRKY15-1，通過酶切連接與植物表達載體PBI121質(zhì)粒進行重組連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CmWRKY15-1基因?qū)刖栈ǎ雠嘤椒☉?yīng)用于抗白色銹病轉(zhuǎn)基因菊花株系的培育；
轉(zhuǎn)CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法包括如下步驟：
（1）菊花CmWRKY15-1基因的克隆
以抗病品種‘雙粉匙’葉片為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序所得到的序列信息設(shè)計特異引物：
上游引物CmWRKY15-1-F：序列如SEQ ID NO.2所示
下游引物CmWRKY15-1-R：序列如SEQ ID NO.3所示；獲得CmWRKY15-1基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示；
結(jié)合PCR擴增目的基因的全長序列，設(shè)計引物：
上游引物CmWRKY15-1-2F：序列如SEQ ID NO.4所示；
下游引物CmWRKY15-1-2R：序列如SEQ ID NO.5所示；在CmWRKY15-1基因的上游和下游分別引入Xba I和Sac I酶切位點獲得PCR產(chǎn)物；
（2）植物表達載體PBI121-CmWRKY15-1的構(gòu)建
將步驟（1）獲得的PCR產(chǎn)物連接到pTOPO-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取陽性質(zhì)粒；
用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I分別對提取的質(zhì)粒及PBI121載體進行雙酶切，PCR電泳檢測回收酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取陽性質(zhì)粒進行雙酶切驗證；
（3）農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化菊花
將步驟（2）制備的陽性質(zhì)粒PBI121-CmWRKY15-1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，獲得陽性克隆農(nóng)桿菌，通過葉盤法轉(zhuǎn)化菊花，將CmWRKY15-1基因轉(zhuǎn)入菊花中，獲得轉(zhuǎn)CmWRKY15-1基因切花菊；
（4）鑒定
該鑒定方法將轉(zhuǎn)CmWRKY15-1基因初步獲得的抗性植株進行PCR鑒定、熒光定量RT-PCR分子檢測，篩選陽性植株，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系；
具體包括如下步驟：
（1）PCR檢測
提取生根篩選得到的卡那霉素抗性待檢測植株基因組DNA，將篩選基因NPTⅡ作為檢測目標，根據(jù)NPTⅡ基因兩端合成擴增反應(yīng)引物，擴增出的片段長為676bp，引物序列為：
上游引物PBI121-NPTⅡ-F：序列如SEQ ID NO.6所示，
下游引物PBI121-NPTⅡ-R：序列如SEQ ID NO.7所示；
分別以卡那霉素抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株DNA為模板，以PBI121-NPTⅡ-F和PBI121-NPTⅡ-R為引物，進行PCR檢測，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析；
（2）熒光定量RT-PCR檢測
提取抗卡那霉素植株葉片及野生型植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，建立熒光定量RT-PCR擴增體系，每個樣品重復(fù)3次，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個樣品的CT值，以野生型植株的表達為基準值，計算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對表達情況；特異引物
擴增出的片段長度為131bp陽性結(jié)果，引物序列：
上游引物CmWRKY15-1-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示，
下游引物CmWRKY15-1-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示；
以Actin擴增的基因片段為內(nèi)參，片段長度為188bp陽性結(jié)果，引物序列：
上游引物Actin-F：序列如SEQ ID NO.10所示，
下游引物Actin-R：序列如SEQ ID NO.11所示；
由PCR、熒光定量RT-PCR檢測呈陽性，確定獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系。
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