[發明專利]一種共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體、質粒、CIK細胞及MM病應用

有效

• 申請號: 201810081993.8
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108314738B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 劉明錄;王立新;強邦明;馮建海;金海鋒;萬磊;韓國英;盧永燦;韓慶梅;劉敏;張傳鵬
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/867;C12N15/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 山東華君知識產權代理有限公司 37300
• 代理人: 武歡歡

1.一種共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體，其特征在于：由CD8leader、BCMAscFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、4-1BB共刺激信號區、CD3ζ胞內信號區、T2A自剪切區、IL-21表達區、T2A自剪切區、CD8leader、CD138scFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、4-1BB共刺激信號區、CD3ζ胞內信號區，依次串聯構成；

BCMA scFv核酸人工序列為SEQ ID NO.3；

CD138scFv核酸人工序列為SEQ ID NO.10。

2.如權利要求1所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體，其特征在于：所述CD8leader核酸人工序列為SEQ ID NO.2；

CD8鉸鏈區核酸人工序列為SEQ ID NO.4；

CD8跨膜區核酸人工序列為SEQ ID NO.5；

4-1BB共刺激區核酸人工序列為SEQ ID NO.6；

CD3ζ信號傳導區核酸人工序列為SEQ ID NO.7；

T2A核酸人工序列為SEQ ID NO.8；

IL-21核酸人工序列為SEQ ID NO.9。

3.如權利要求2所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體，其特征在于：所述嵌合抗原受體的核酸序列為SEQ ID NO.1。

4.如權利要求1-3任一項所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體，其特征在于：采用包括如下步驟的制備方法得到：

(1)分別按CD8leader核酸人工序列、BCMA scFv核酸人工序列、CD8鉸鏈區核酸人工序列、CD8跨膜區核酸人工序列、4-1BB共刺激區核酸人工序列、CD3ζ信號傳導區核酸人工序列、T2A核酸人工序列、IL-21核酸人工序列、T2A核酸人工序列、CD8leader核酸人工序列、CD138scFv核酸人工序列、CD8鉸鏈區核酸人工序列、CD8跨膜區核酸人工序列、4-1BB共刺激區核酸人工序列、CD3ζ信號傳導區核酸人工序列合成其整個表達框并插入標準載體pUC57上得到pUC-MmCAR；

(2)將pUC-MmCAR進行雙酶切，利用瓊膠電泳將含有MmCAR DNA片段瓊膠部位切下，利用DNA extraction kit溶膠液處理、過DF柱棄濾液、漂洗DF柱、空離、洗脫DF柱、收集離心物，得到純化的MmCAR DNA片段，即本發明所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體。

5.一種質粒，其特征在于：所述質粒表達如權利要求1所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體。

6.如權利要求5所述的一種質粒，其特征在于：所述質粒是將SEQ ID NO.1所示的融合基因片段插入慢病毒表達載體pLent-C-GFP得到。

7.如權利要求5或6所述的一種質粒，其特征在于：所述質粒采用包括如下步驟的方法制備得到：將純化的SEQ ID NO.1所示的 DNA片段和線性化的pLent-C-GFP DNA片段，在連接體系為： 10×buffer：1μL；T4連接酶：1μL；SEQ ID NO.1所示的DNA片段：4μL；線性化的pLent-C-GFP DNA：4μL的條件下過夜連接形成包含SEQ ID NO.1所示的DNA片段的慢病毒表達質粒。

8.CIK細胞，其特征在于：所述CIK細胞包含如權利要求1所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體。

9.如權利要求8所述的CIK細胞，其特征在于：所述CIK細胞采用包括如下步驟的方法制備得到：首先將包含SEQ ID NO.1所示的DNA片段的慢病毒表達質粒進行慢病毒包裝，然后利用重組慢病毒感染 CIK細胞。

10.如權利要求1所述的共表達細胞因子IL-21的雙特異性嵌合抗原受體在制備治療多發性骨髓瘤病的藥物中的應用。