[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810081408.4
• 申請(qǐng)日: 2018-01-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108300806A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾蕓;蘇接瑜;李睿君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

本發(fā)明公開(kāi)一種快速檢測(cè)Ferlavirus病毒的RT?PCR引物及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物細(xì)菌學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述RT?PCR引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成；上述引物用于制備檢測(cè)Ferlavirus病毒的RT?PCR試劑盒。該試劑盒提供的RT?PCR檢測(cè)方法具有高度的特異性和敏感性，重復(fù)性好，可信度高，快速準(zhǔn)確的獲得檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便，解決了傳統(tǒng)鑒別方法分離率低，耗時(shí)費(fèi)力等不足，適合基層使用，可作為Ferlavirus病毒實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速、簡(jiǎn)便、低成本檢測(cè)Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在1972年瑞士的一個(gè)蛇類展覽館的矛頭蛇（Ferdelance）出現(xiàn)呼吸困難、嗜睡、神經(jīng)癥狀，死亡率達(dá)30%，此后D.W.Folsch從一條矛頭蛇分離到一株副黏病毒，這是第一次從爬行動(dòng)物分離到副黏病毒的報(bào)道。由于是從矛頭蛇分離的緣故，故將病毒株命名為Fer-de-Lance(FDLV)。2011年，國(guó)際病毒分類委員會(huì)同意以FDLV為代表的代表毒株增加一個(gè)新的副黏病毒屬--Ferlavirus的提議。

Ferlavirus主要引起蛇呼吸系統(tǒng)疾病，臨床特征主要表現(xiàn)不同程度的呼吸困難、口腔有粘液、飲水增多，部分蛇出現(xiàn)頭震顫等神經(jīng)癥狀；病理變化主要表現(xiàn)為肺水腫、充血、出血，嚴(yán)重的肺表面產(chǎn)生大量分泌物呈豆腐渣樣或干酪樣，氣管有大量痰液，肝、脾腫大，胰腺壞死、出血，腸道出血等。由Ferlavirus引起的蛇肺炎是人工養(yǎng)殖蛇最常見(jiàn)疾病之一，目前缺乏對(duì)防治該病毒的相關(guān)疫苗和藥物，所以一旦發(fā)病往往引起高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的損失。因此由Ferlavirus感染引起的蛇肺炎是制約養(yǎng)蛇行業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的巨大障礙。

對(duì)于Ferlavirus的檢測(cè)目前有多種方法，包括病毒分離、電子顯微鏡技術(shù)、免疫組化學(xué)技術(shù)、原位雜交技術(shù)、血凝抑制反應(yīng)（HI）、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)（HA）、RT-PCR技術(shù)。雖然病毒分離、電子顯微鏡技術(shù)、免疫組化學(xué)技術(shù)、原位雜交技術(shù)都能夠檢測(cè)組織樣本中是否有Ferlavirus病毒，但是這些檢測(cè)方法在儀器設(shè)備要求上比較苛刻、技術(shù)繁瑣、成本高、時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，難以在臨床上對(duì)大規(guī)模的樣本進(jìn)行快速檢測(cè)。臨床對(duì)于Ferlavirus上用得較多的是HI、HA、RT-PCR方法。由于Ferlavirus病毒能夠凝集紅細(xì)胞，所以用HA可以快速、簡(jiǎn)單的檢測(cè)樣本中的Ferlavirus病毒，但是該方法在特異性和敏感性存在的嚴(yán)重的缺陷。用HA方法進(jìn)行病毒檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性；相比敏感性，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RT-PCR反應(yīng)。在臨床上已經(jīng)存在商業(yè)HI試劑盒對(duì)Ferlavirus病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，但是目前對(duì)于Ferlavirus病毒的血清型分類目前尚未弄清楚 ，國(guó)外多位學(xué)者在用不同的毒株作為抗原檢測(cè)臨床樣本時(shí)，結(jié)果差異較大。 所以血清型的差異，用HI檢測(cè)Ferlavirus病毒可能會(huì)存在漏檢。RT-PCR方法具有快速、特異性高、成本低、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，是臨床檢測(cè)Ferlavirus病毒的主要方法。目前有根據(jù)Ferlavirus的F、HN、U等為靶基因設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),但是由于Ferlavirus至少存在著三個(gè)亞組，這些方法大多局限在某一亞組上，敏感性上還存在不足。因此能夠設(shè)計(jì)出一對(duì)保守性強(qiáng)、特異性高、敏感性好的引物對(duì)于采用RT-PCR檢測(cè)多樣性的Ferlavirus十分有必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供低成本、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，使用如下的技術(shù)方案：

一種快速檢測(cè)Ferlavirus病毒的RT-PCR引物，所述RT-PCR引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物組成，引物序列為：

引物上游序列L-F： 5'-GCAGAGATTTTCTCTTTCTT-3' SEQ ID NO:1