[發明專利]一種用于檢測HPV18的RPA熒光定量引物對、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810081154.6
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108315476A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 張大龍;羅春華;戴群瑩;胡小偉;韓斌;華紹炳
• 申請（專利權）人: 杭州德同生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈自軍

本發明公開了一種用于檢測HPV18的RPA熒光定量引物對、探針、試劑盒及方法。本發明RPA熒光定量引物對是針對HPV18病毒的基因組中的L1區域設計篩選獲得的，本發明方法為基于RPA技術的熒光定量檢測方法，可用于特異性檢測HPV18，該方法操作簡便，靈敏度高，反應條件溫和，反應時間短，結合便攜式的熒光檢測儀即可進行病原微生物的快速定量檢測。RPA熒光定量擴增后，再用測流層析試紙條結合便攜式的干式熒光免疫分析儀進行結果檢測分析，從而整個過程中涉及的儀器均為小體積便攜式，不受實驗儀器和場地限制，并且在很大程度上減少了傳統的膠體金等顯色法結果判定時人為因素的影響，靈敏度可以達到5拷貝。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種用于檢測HPV18的RPA熒光定量引物對、探針、試劑盒及方法。

背景技術

人類乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，在人和動物中分布廣泛，有高度的特異性，長期以來，已知HPV可引起人類良性的腫瘤和疣，如生長在生殖器官附近皮膚和粘膜上的人類尋常疣、尖銳濕疣以及生長在粘膜上的乳頭狀瘤。流行病學和分子學研究證實了HPV感染是宮頸癌的病因。生殖道HPV感染是一種常見的性傳播疾病。由于女性宮頸癌發生的主要原因是長期反復的高危型HPV感染，故HPV DNA的快速檢測為預防和治療宮頸癌的最有效手段之一。

核酸擴增PCR技術由于其靈敏度高和特異性強等方面的優勢，已經成為科學研究和臨床研究中的一個基礎和必要的技術手段。然而，PCR技術通常需要特制的儀器以及復雜的反應程序，成本高，耗時長，對于需要實時、現場、快速的非實驗室環境檢測及分析通常難以實現。

近年來，基于模擬體內核酸復制、轉錄、修復機理發展起來的核酸體外等溫擴增(Nucleic acid isothermal amplification，NCIA)技術的出現，解決了PCR技術上的局限，不僅簡化了對儀器的要求，不需要昂貴的PCR儀，還縮短了反應時間，恒溫條件下即可快速擴增出目標核酸片段。因其反應快速、靈敏度高、操作簡便等優點而受到了多個領域的關注，尤其是體外診斷領域。目前，報道的NCIA技術有loop介導的體外恒溫擴增(Loop-mediate isothermal amplification，LAMP)，核酸序列依賴擴增(Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)，鏈置換擴增(Strand displacement amplification，SDA)，滾環擴增技術(rolling circle amplification，RCA)。但這些恒溫擴增技術在反應條件、反應試劑、反應時間、儀器設備以及操作簡便性等方面存在較大的弊端。如LAMP對引物要求高，設計復雜，且產物結構復雜。NASBA通常擴增時間較長(約2-3小時)，需要抽提RNA，且當模板是DNA時需要高溫變性處理。SDA需要反應前對模板進行熱變性處理，才能引發帶有核酸內切位點引物的配對。RCA需要設計一段鎖式探針，通常在100bp左右，合成費用較高，并且在RCA反應過程中未成環的鎖式探針和未結合探針的模板DNA或者RNA可能產生一些背景信號。

重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)能夠在恒溫條件下(37℃-42℃)實現對核酸的快速特異性擴增，且在20min內可將核酸擴增至可檢測水平，具有良好的可操作性，能夠在非實驗室條件下完成核酸檢測，被稱為是最具有可替代PCR潛力的核酸檢測技術，且可以和瓊脂糖凝膠檢測、熒光檢測技術結合實現實時、快速甚至定量檢測。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的不足，提供了一種用于檢測HPV18的RPA熒光定量引物對、探針、試劑盒及方法。

一種用于檢測HPV18的RPA熒光定量引物對，包括上游引物和下游引物，序列為

上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；