[發明專利]大菱鲆生精上皮不同發育時期生殖細胞及體細胞的標記方法及應用

有效

• 申請號: 201810075341.3
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108330195B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 柳意樊;劉清華;李軍;徐世宏;王彥豐
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學;中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6841
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.大菱鲆生精上皮不同發育時期生殖細胞及sertoli細胞的標記方法，包括：探針的制備、切片的制備、熒光原位雜交，其特征在于：所述切片的制備步驟為：雜交前實驗所用器皿，試劑均采用0.1%DEPC處理，并高壓消毒；用多聚甲醛溶液固定樣品過夜，使用梯度甲醇脫水，之后以石蠟包埋，將包埋好的性腺樣品進行組織切片，切片厚度為4-5μm，切片用DEPC處理水展好，烘干過夜后冷藏；

所述切片的制備步驟中多聚甲醛溶液的濃度為3-4%，將多聚甲醛溶解于pH為7.4的磷酸緩沖液中即得；

所述探針的制備步驟為：從大菱鲆精巢cDNA中擴增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05%瓊脂糖電泳膠回收，亞克隆并連接到PGEM-Teasy載體，轉化大腸桿菌感受態，挑選陽性克隆并測序，挑取含選擇正確插入方向的單克隆，中量提取質粒；采用限制性內切酶NcoI、SpeI分別線性化質粒，利用PCR產物回收純化試劑盒純化線性化的片段并用DEPC處理水溶解，并采用核酸定量儀定量；用T7和SP6 RNA轉錄酶分別合成反義和正義探針；

所述熒光原位雜交步驟為：將切片經脫蠟復水操作后置于65℃預雜交液中1-2小時，然后進行雜交，雜交結束后在65℃溫度下，以2×SSCT/50%去離子甲酰胺洗滌2*30min，然后以2×SSCT洗滌15min，以0.2×SSCT洗滌2*30min；室溫下以1×PBST洗滌3*5min；室溫下以2%封閉液封閉1-2h；室溫下以2%封閉液按1:500稀釋抗體，稀釋2小時；室溫下1×PBST洗滌5*10min，1×PBS洗滌5*10min；室溫下將熒光放大劑按1:150稀釋，孵育1小時；1×PBST洗滌5*10min；然后重復進行封閉、稀釋抗體、洗滌操作，最后進行細胞核染色，封片后觀察拍照；

所述熒光原位雜交包括Amh/Sox9組合的雙色熒光原位雜交和Sox9/Gsdf組合的雙色熒光原位雜交；

所述Amh/Sox9組合的雙色熒光原位雜交后，在Ⅱ期精巢，Amh/Sox9特異性顯色于精原細胞和周圍的Sertoli細胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Amh在細胞核濃縮基本完成的變態晚期精細胞和精子上不顯色，而Sox9在Sertoli細胞和各時期生殖細胞上都顯色；

所述Sox9/Gsdf組合的雙色熒光原位雜交后，在Ⅱ期精巢，Sox9特異性顯色于精原細胞周圍的Sertoli細胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Sox9在Sertoli細胞和各時期生殖細胞上都顯色；

在各時期精巢中，Gsdf僅特異性顯色于精原細胞周圍的Sertoli細胞。

2.根據權利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同發育時期生殖細胞及sertoli細胞的標記方法，其特征在于：所述探針的制備步驟中，用于鑒定大菱鲆生精上皮不同發育時期不同細胞類型的基因原位雜交探針合成引物為：Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG。

3.根據權利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同發育時期生殖細胞及sertoli細胞的標記方法，其特征在于：所述探針的制備步驟中，反義探針合成時反應各物質及其含量為：酶切質粒1μg、10×NTPmix 2μL、10×Buffer 2μL、RNase Inhibitor 1μL、T7 2μL，以DEPC處理水加至20μL；正義探針合成時反應各物質及其含量為：酶切質粒1μg、10×NTPmix 2μL、10×Buffer 2μL、RNase Inhibitor 1μL、SP6 2μL，以DEPC處理水加至20μL。