[發明專利]一種對非酒精性脂肪肝模型具有修復作用的青蛤多肽制備方法

在審

• 申請號: 201810074034.3
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108277249A
• 公開（公告）日: 2018-07-13
• 發明（設計）人: 楊最素
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/36
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

1.一種對非酒精性脂肪肝模型具有修復作用的青蛤多肽制備方法，其特征在于所述的制備方法包括：選取原料青蛤內臟進行酶解獲得青蛤多肽，將獲得的青蛤多肽作用于NAFLD體外細胞模型進行篩選酶解條件，通過分離純化獲得對非酒精性脂肪肝模型具有修復作用的青蛤多肽產品。

2.根據權利要求1所述的對非酒精性脂肪肝模型具有修復作用的青蛤多肽制備方法，其特征在于所述的選取原料青蛤內臟進行酶解獲得青蛤多肽是：

a）從原料青蛤中取內臟并清洗后搗碎制成漿料，

b）酶解：選用蛋白酶對青蛤內臟漿料進行酶解，制成酶解液；

c）超濾：將酶解液加入超濾系統，用10KD、5KD、3KD的超濾膜進行超濾，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液；

d）將酶解液用葡聚糖凝膠Sephadex G25進行凝膠柱層析和緩沖液洗脫，分別收集各峰后，在建立NAFLD體外細胞模型的基礎上，采用細胞指數級富集的配體系統進化技術針對NAFLD細胞進行篩選，獲得能特異性識別NAFLD細胞表面膜蛋白結構的、有生物活性的峰，再用反相高效液相色譜(RT- HPLC)純化；

e）經過反相高效液相色譜(RT- HPLC)純化及氨基酸序列檢測，獲得對非酒精性脂肪肝模型具有修復作用的青蛤多肽。

3.根據權利要求2所述的對非酒精性脂肪肝模型具有修復作用的青蛤多肽制備方法，其特征在于：

所述的步驟b）中，蛋白酶為胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解溫度為42℃、pH值為2、料液比為1:8—12 g/mL、時間為6—10 h、加酶量為1500—1600 u/g；

所述的步驟d）中，所述的凝膠柱層析和緩沖液洗脫是：PH8.5Tris-HC1 緩沖液，0 ～0.03mol/NaCl 梯度洗脫，收集有活性的各峰，凍干后，凝膠柱脫鹽；

所述的NAFLD體外細胞模型是應用Cell-SELEX技術對NAFLD細胞展開篩選，經過24輪正負細胞篩選后成功富集到針對NAFLD細胞的ssDNA文庫，經過測序分析找到了4條核酸適配體與NAFLD細胞有結合，而與HepG2細胞不結合，選用結合能力強的1條核酸適配體進行實驗，并命名為NFD-1；在4度和37度條件下，核酸適配體NFD-1均能與NAFLD細胞特異性結合；

所述的步驟e）中，所述反相高效液相色譜，即RT- HPLC，用RT-HPLC進行純化，色譜條件是:

1)樣品前處理:將樣品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，離心12000-14000RPM，離心10分鐘后取上清；

2)系統: Agilent 1260 HPLC；

3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um；

4)進樣體積:80-100ul；

5)緩沖液、平衡緩沖液: 0.06%TFA洗脫緩沖液: 0.05%TFA的乙腈；

6) 梯度:0%–0 % B洗脫4分鐘，0%–8% B洗脫25分鐘，8%-100%B洗脫1分鐘，100% -100%B洗脫5分鐘；

7)流速:1.0 ml/min；8）檢測:280nm/214nm。