[發明專利]用于檢測水稻不育基因tms5的SNP分子標記

在審

• 申請號: 201810073672.3
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN107988221A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 彭佩;賀治洲;張先文;吳云天
• 申請（專利權）人: 華智水稻生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京市中聯創和知識產權代理有限公司11364
• 代理人: 郭峰,康秀敏

技術領域：

本發明涉及分子標記領域，具體的，涉及一個水稻不育基因的SNP分子標記。

背景技術：

水稻是重要的糧食作物，推廣雜交水稻是提高水稻產量的重要途徑。在兩系雜交水稻生產中，溫敏不育系有著舉足輕重的地位，目前在生產上大面積利用的溫敏不育系通常在高溫條件下表現為雄性不育，作為母本來產生雜交種，在低溫條件下，恢復育性完成自身的繁殖。傳統的兩系不育系的選育在抽穗揚花期觀察水稻的花粉育性和選擇田間不育株，需要經歷花粉鏡檢、套袋自交、選出的不育株割蔸再生和改變生態環境進行育性轉選擇等費時費力的過程。隨著生物技術的發展，育種家可利用分子標記對控制不育性狀的基因進行鑒定，準確區分純合不育、雜合不育和可育株，顯著提高選擇效率和加快兩系雜交稻的育種進程。

以往文獻報道中主要利用的分子標記類型為AFLP、RFLP、SSR和InDel標記篩選基因，在育種中存在多態性較低，差異較小的缺點。檢測過程中使用的EB或聚炳烯酰胺易對環境造成污染、對人體產生危害。傳統檢測手段以花藥鏡檢和結實率等表型觀測鑒定為主，耗費時間長，且易受環境條件的限制，鑒定結果存在誤差，選擇效率較低。

我國種植的兩系雜交稻中，tms5基因是控制我國溫敏不育系的主要基因，目前推廣應用的兩系雜交稻品種大都是用帶有tms5的不育系培育而成。不育基因tms5來源于第一個被發現的溫敏不育系安農S-1，也控制秈S和N28S等多個核不育系的高溫敏感性雄性不育。2003年Wang等利用重組自交系將安農S-1中的溫敏不育基因定位于第2染色體的標記C365和G227之間，并將該基因命名為tms5；2006年，有研究者將tms5基因進一步定位到SSR標記RMAN7和RMAN54之間的181kb，并發現了位于第2染色體的31.2cM處與tms5基因共分離的EST標記HN57。2007年Yang利用3個不同的群體將tms5精細定位在BAC克隆AP004039上4039-1和4039-2之間的19kb范圍內，并認為轉錄因子基因ONAC023是可能的候選基因。2014年莊楚雄團隊利用2個F2群體將tms5定位在BAC克隆OJ1106-D5上的6.9kb范圍內，此區間有一個編碼RNase Z的基因序列，編碼區的第71位堿基由C突變為A，導致提前形成終止密碼子TAG，無法切割受高溫誘導且花粉母細胞特異表達UbL40mRNA，從而控制水稻溫敏雄性不育(數據來源于國家水稻數據中心)。

CN105483225A公開了一組水稻溫敏核不育基因tms5的功能特異性分子標記及其應用，根據引起水稻溫敏核不育基因tms5功能變化的單堿基突變(C-A)，設計了一系列能特異擴增野生型C和突變型A的引物，并在3’端位置引入錯配堿基，利用限制性內切酶對PCR產物酶切，將野生型和突變型準確的區分開。CN106191252A公開了鑒定tms5基因水稻種子的引物組，利用熒光定量PCR鑒別水稻tms5不育系。上述兩種方法都是通過熒光PCR對結果進行檢測，但此種方法引物設計較為復雜，結果的表征也不夠直觀。

因此本領域亟需一種能夠快速簡便的對tms5分型的檢測方法。

發明內容：

有鑒于此，提出本發明。

CN105483225A、CN106191252A兩篇背景文獻以引用的形式并入本文。

本發明要解決的技術問題是開發一組不育基因tms5的分子標記，其能用于tms5基因的高效鑒定及輔助選擇育種。為了解決上述技術問題，本發明提供tms5共分離的SNP(single nucleotide polymorphism)分子標記。

首先，由于tms5基因已被克隆，根據相關文獻可知tms5基因是由單堿基突變引起的不育性的差異。根據相關文獻tms5基因是由單堿基突變引起的不育性的差異，將已發表tms5基因序列及與日本晴參照基因組(MSU7.0)比對，確定該SNP在水稻2號染色體的6397412位。以候選SNP位點為中心提取兩側50bp側翼序列，并進行引物設計。標記有三條引物，兩條針對關鍵位點堿基差異設計的特異性引物，一條通用引物。利用20份含有tms5基因的水稻供體品種和24份非供體水稻品種進行KASP反應測試驗證，標記K_020503擴增效果佳，且能準確區分測試材料中tms5基因的供體與非供體。標記信息如表1所示。

表1：標記信息