[發明專利]一種生產阿洛酮糖的工程菌株，其構建方法及應用

在審

• 申請號: 201810072372.3
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN110079488A
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 楊建剛;孫媛霞;朱玥明;門燕;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/02;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種生產阿洛酮糖重組菌株的構建方法及應用。所述構建方法通過調控葡萄糖胞內代謝，降低谷氨酸棒桿菌中果糖6?磷酸激酶和葡萄糖6?磷酸脫氫酶的酶活性，增強葡萄糖激酶和葡萄糖6?磷酸異構酶酶活性從而提高胞內果糖6?磷酸的含量，構建由6?磷酸阿洛酮糖3?差向異構酶和6?磷酸阿洛酮糖磷酸化酶組成的阿洛酮糖合成途徑，由果糖透過酶和果糖激酶組成的果糖代謝途徑，以及由甘油透過酶、甘油脫氫酶和二羥丙酮激酶組成的甘油代謝途徑；獲得了一株谷氨酸棒桿菌重組菌株，該菌株可以代謝甘油、葡萄糖、果糖或者蔗糖合成阿洛酮糖，與目前報道的生物轉化果糖合成阿洛酮糖方法相比，具有轉化率高、生產成本低等優點，適合規模化生產阿洛酮糖。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種生產阿洛酮糖工程菌，該工程菌的制備方法以及將其用于發酵生產阿洛酮糖中的應用。

背景技術

稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物(2002年國際稀少糖學會ISRS定義)。近年來，D-阿洛酮糖作為果糖的差向異構體在膳食、保健、醫藥等領域引起了廣泛關注，阿洛酮糖其甜度為蔗糖的70％，然而能量值僅為0.007kcal/g，且能量吸收效率僅為蔗糖的0.3％，是一種非常理想的低卡路里甜味劑，可作為蔗糖替代品應用于食品領域；D-阿洛酮糖被證明具有降血糖的作用，還可以抑制肝臟脂肪合成酶腸道α-糖苷酶的活性，從而減少腹部脂肪的累積，在治療神經退行性和動脈粥樣硬化疾病方面也有很高的醫療價值。美國食品及藥品管理局(FDA)于2011年正式批準D-阿洛酮糖為GRAS食品，允許應用到食品、醫藥制劑以及膳食補充劑中，因此，D-阿洛酮糖具有良好的應用前景和開發價值。

目前生產阿洛酮糖主要通過化學合成和生物轉化兩種方法，化學合成需要多步保護和脫保護步驟，生產成本高且收率低。生物轉化法以果糖為原料，經D-阿洛酮糖3-差向異構酶催化合成D-阿洛酮糖，該方法催化合成效率較高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式，然而該方法轉化率低，目前最高只能達到32％的轉化率，需要添加模擬流動床設備實現果糖循環利用，造成產物不易分離，阿洛酮糖生產成本升高，亟待開發一種低成本，低污染，高產率的阿洛酮糖合成新方法。當細胞代謝葡萄糖、果糖等多種碳源時，可以胞內合成果糖6-磷酸，后者可以經阿洛酮糖6-磷酸差向異構酶催化為阿洛酮糖6-磷酸，再經去磷酸化酶合成阿洛酮糖，該合成路線具有轉化率高的優點，因此本發明提出采用基因工程技術和微生物學方法構建微生物工程菌株，再以廉價的葡萄糖、果糖為底物發酵生產阿洛酮糖的新思路。

發明內容

本發明的目的一是提供一種生產阿洛酮糖工程菌株的構建方法。所述構建方法包括以下步驟：

(1)增強葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸異構酶的酶活性，其特征為通過引入強啟動子或者采用質粒表達形式提高葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸異構酶基因的表達強度，或者采用染色體整合方式整合其他物種來源的酶活性更高的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸異構酶基因。

(2)降低果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脫氫酶的酶活性，其特征為采用基因敲除或者引入弱啟動子方式，降低細胞果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脫氫酶基因的表達水平。

(3)增強6-磷酸阿洛酮糖3-差向異構酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶的酶活性，其特征為采用染色體整合或者質粒表達形式，向胞內引入6-磷酸阿洛酮糖3-差向異構酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因。

(4)增強果糖透過酶和果糖激酶的酶活性，其特征為采用強啟動子、染色體整合或者質粒表達形式，增強果糖透過酶和果糖激酶基因的表達水平。

(5)增強甘油透過酶、甘油脫氫酶和二羥丙酮激酶的酶活性，其特征為采用強啟動子、染色體整合或者質粒表達形式，提高甘油透過酶、甘油脫氫酶和二羥丙酮激酶基因的表達水平。