[發(fā)明專利]一種人類精子活率及其DNA損傷雙參數(shù)檢測及分析的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810071175.X
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108398407B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高雅晶;樊曉翔;葉穎
• 申請（專利權(quán)）人: 邁克博（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人類精子活率及其DNA損傷雙參數(shù)分析的試劑盒在制備用于一種人類精子活率及其DNA損傷雙參數(shù)檢測的試劑盒中的應(yīng)用，其中，

所述人類精子活率及其DNA損傷雙參數(shù)分析的試劑盒包括緩沖液、Live-or-DyeCF^TM640R熒光染料、酸化液和AO染色液，其中，

所述緩沖液是由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鈉和乙二胺四乙酸組成的混合物，緩沖液的pH值為7.4，且三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的濃度為0.01mol/L，氯化鈉的濃度為0.15mol/L，乙二胺四乙酸的濃度為1mmol/L，

所述酸化液是由鹽酸、氯化鈉和曲拉通X-100組成的混合物，酸化液的pH值為1.2，且酸化液中鹽酸的濃度為0.08mol/L、氯化鈉的濃度為0.15mol/L、曲拉通X-100的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％，

和，所述AO染色液是由濃度為1mg/mL的AO配制而成的終濃度為8.5μg/mL的染色液；

而且，所述人類精子活率及其DNA損傷雙參數(shù)檢測的步驟由如下步驟組成：

S1、取精子標(biāo)本，加入2ml所述緩沖液，渦旋混勻，350g離心5min，棄去上清液，得精液原液，將精液原液在顯微鏡下觀察，并計(jì)算精子濃度，根據(jù)計(jì)算的精子濃度，向精液原液中加入所述緩沖液，調(diào)整至精子濃度為1～2×10⁶個/ml，得到精液稀釋液；

S2、流式細(xì)胞管中加入Live-or-Dye CF^TM640R熒光染料，再加入步驟S1得到的精液稀釋液，孵育15～30min，再加入2ml所述緩沖液，渦旋混勻，離心，棄去上清液，加入所述酸化液酸化處理30s，再加入所述AO染色液，得精液待測樣品，其中，所述Live-or-Dye CF^TM640R熒光染料和精液稀釋液的體積比為1：100；

S3、取與步驟S2相同量的所述酸化液和所述AO染色液混合作為平衡緩沖液，將平衡緩沖液加入到對照流式細(xì)胞管內(nèi)，然后設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，將對照樣品瓶放置在流式細(xì)胞儀上，調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀的電壓和補(bǔ)償，調(diào)節(jié)細(xì)胞的流速為200～300個/s，并運(yùn)行15min；

S4、取步驟S2制備的精液待測樣品置于樣品室內(nèi)，樣品進(jìn)入樣品室后立即啟動樣品流，檢測精液待測樣品，收集精液待測樣品中精子的FITC/PerCP/APC通道的熒光信號；

S5、重復(fù)步驟S4，重復(fù)檢測樣品，每個樣品至少連續(xù)檢測兩次，每次至少分析5000個細(xì)胞，每個樣品最后一次檢測后使用步驟S3的對照樣品瓶內(nèi)的平衡緩沖液重新平衡1min，再用10％的漂白劑清洗5min，再用除菌水清洗10min，然后利用軟件分析精子的PerCP通道的紅熒光信號和FITC通道的綠熒光信號，通過收集到紅色熒光精子占所收集精子的比例，判定樣本的DNA碎片指數(shù)，分析精子APC通道的紅色熒光，通過收集紅色熒光精子的比例，判定樣本中精子的活率，完成人類精子活率及其DNA倍體損傷的檢測，用于區(qū)分出多種染色差異性精子細(xì)胞群：

CF640陰性且DNA綠色表示膜通透性完整且DNA結(jié)構(gòu)完整；

CF640陰性且DNA紅色表示膜通透性完整且DNA結(jié)構(gòu)改變；

CF640陽性且DNA綠色表示膜通透性改變且DNA結(jié)構(gòu)完整；

CF640陽性且DNA紅色表示膜通透性改變且DNA結(jié)構(gòu)改變，

只有DNA結(jié)構(gòu)與膜通透性這兩個參數(shù)都正常的精子，即染色模式CF640陰性且DNA綠色才能稱之為正常精子，而膜結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)構(gòu)任意一個參數(shù)改變，都預(yù)示著精子生物學(xué)功能受損。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述精子標(biāo)本為新鮮精子或凍存精子中的任意一種，其中，所述凍存精子在使用前需要進(jìn)行解凍。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟S2中，所述離心的離心力為350g，離心時間為5min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)采用校準(zhǔn)微球?qū)崿F(xiàn)，所述調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀的電壓和補(bǔ)償采用樣品管的方式。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述軟件為BD Callibur分析軟件。