[發明專利]豬α腸道冠狀病毒及其培養方法和應用

有效

• 申請號: 201810070004.5
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108384762B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 田小艷;李春梅;潘永飛;王東東;歐陽海平;宋延華
• 申請（專利權）人: 溫氏食品集團股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;G01N33/569;C12Q1/70;C12Q1/6869;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 廣州容大知識產權代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

本發明涉及微生物病毒領域，具體涉及豬α腸道冠狀病毒及其培養方法和應用。本發明的豬α腸道冠狀病毒核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示。本發明還提供了優化后的豬α腸道冠狀病毒分離培養方法，優化了敏感細胞系和培養條件，讓病毒更好的適應體外細胞，可使用病樣樣品直接接種Vero細胞；同時使病毒滴度明顯提高，對豬α腸道冠狀病毒后續的研究和工業化利用提供了更好基礎條件。

技術領域

本發明涉及微生物病毒領域，具體涉及豬α腸道冠狀病毒及其培養方法和應用。

背景技術

引起豬腹瀉的豬冠狀病毒病主要有豬傳染性胃腸炎(TGEV)和豬流行性腹瀉(PEDV)。不同年齡和不同品種的豬均易感，但對哺乳仔豬的危害最為嚴重，以水瀉、嘔吐和脫水為主要癥狀。2010年入冬以來，豬流行性腹瀉病毒變異株開始在我國流行，并導致全國范圍內的嚴重爆發，初生仔豬感染后死亡率達90％以上；隨后，可導致仔豬腹瀉的新型腸道冠狀病毒Delta冠狀病毒(PDCoV)也被發現；冠狀病毒的高變異特性目前已經成為仔豬腹瀉防控的難點，給養豬業造成巨大經濟損失，對養豬業的發展形成嚴重威脅。

2017年初，廣東部分豬場先后發生以新生仔豬嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的高度接觸性傳染病，主要表現為哺乳仔豬高發病率和高死亡率。技術人員通過實驗室檢測排除了常見豬腹瀉相關病原感染，懷疑有新病毒株感染，亟待進一步鑒定和制定防治方案。

發明內容

鑒于此，本發明通過收集臨床病料，篩選敏感細胞系、優化培養條件，成功分離到一株病毒，對分離的病毒進行生物學特性研究、分子進化分析及動物回歸試驗確證了此次引發個別豬場發生腹瀉的病原是一種新型的豬腸道冠狀病毒。通過全基因序列分析發現其同源性與蝙蝠α冠狀病毒同源性最高，因此將其命名為豬α腸道冠狀病毒 (Swine entericalphacoronavirus SeACoV)。本發明還通過建立 SeACoV體外培養條件，對分離到的病毒進行鑒定，此毒株的成功分離鑒定為該病的防控提供了突破口，為后續研究奠定了基礎，其結果具有重要意義。

本發明技術方案如下：

一種豬α腸道冠狀病毒SeACoV-GD02/2017,保藏號：CCTCC NO:V201801；保藏日期：2017年12月24日；保藏單位：中國典型培養物保藏中心；地址：中國武漢，武漢大學；其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示。

進一步的，所述豬α腸道冠狀病毒與蝙蝠腸道阿爾法冠狀病毒 HKU2在全基因組核酸水平上的同源性為94.9％；與馬鐵菊頭蝠阿爾法冠狀病毒YN2012在全基因組核酸水平上的同源性為88.3％。

一種豬α腸道冠狀病毒的分離培養方法，包括步驟：

(1)病料采集與處理；

(2)將步驟(1)中所得到病料進行傳代培養；

(3)對步驟(2)培養所得產物進行篩選檢測。

進一步的，所述步驟(2)傳代培養時，采用Vero細胞，配合含胰蛋白酶的維持液。

進一步的，所述步驟(2)傳代培養操作方法包括：將病料直接接種于經含胰蛋白酶的DMEM洗過的Vero細胞；在37℃的5％CO₂條件下于含胰蛋白酶的吸附液中吸附；然后再于含胰蛋白酶的維持液中培養；重復上述操作進行傳代培養。

進一步的，所述步驟(2)中胰蛋白酶的終濃度為6μg/mL。

進一步的，所述步驟(2)傳代培養時，每次傳代前，將上一代的細胞培養物反復凍融3次。

進一步的，所述豬α腸道冠狀病毒在制備豬α腸道冠狀病毒病的診斷試劑中的應用。

進一步的，所述豬α腸道冠狀病毒在制備預防豬α腸道冠狀病毒病的疫苗中的應用。

本發明有益效果：