[發明專利]虹鱒抗傳染性造血器官壞死病卵黃抗體的制備及其應用

在審

• 申請號: 201810069480.5
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108409857A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 汪開毓;魏文燕;李良玉;唐洪;劉韜;楊馬;楊倩;張小麗;何潔;劉家星;何琦瑤;楊壯志;謝恒;陳霞;何晟毓;陳健;朱玲
• 申請（專利權）人: 四川農業大學;成都市農林科學院
• 主分類號: C07K16/02
• 分類號: C07K16/02;C07K16/10;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/34;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 成都厚為專利代理事務所(普通合伙) 51255
• 代理人: 夏柯雙

1.虹鱒抗傳染性造血器官壞死病卵黃抗體的制備，其特征在于，包括如下步驟：

S1. IHNV滅活抗原制備：將IHNV毒液加入到FHM細胞中培養得到IHNV病毒液，并以β-丙內酯為滅活劑制得IHNV滅活抗原；

S2. 蛋雞免疫：用S1制得的IHNV滅活抗原免疫蛋雞；

S3.高免蛋卵黃收集：采集免疫后蛋雞的雞蛋得到高免蛋，高免蛋消毒晾干后采集卵黃，并剪破卵黃膜得到卵黃液；

S4. 卵黃抗體去脂提純，包括如下步驟：

S4.1.卵黃抗體液提取：取S3步驟中得到的卵黃液，在卵黃液中加入生理鹽水并攪拌，其中卵黃液和生理鹽水的體積比為1：（0.8-1.2），將混合液室溫靜置后于3℃-6℃離心，收集上清液；

S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中加入氯仿并攪拌，其中上清液和氯仿的體積比為1：（0.9-1.1），將混合液于-30℃~-10℃靜置，之后于3℃-6℃離心，收集上清液得到IgY提取液；

S4.3.初次沉淀提純：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中加入飽和硫酸銨溶液并攪拌，其中IgY提取液和飽和硫酸銨溶液的體積比為（1.8~2.3）：1，將混合液于3℃-6℃靜置，之后于3℃-6℃離心，分別收集上清液和沉淀；

S4.4.二次沉淀提純：取S4.3中得到的上清液，在上清液中加入飽和硫酸銨溶液并攪拌，其中上清液和飽和硫酸銨溶液的體積比為（0.95~1.05）：1，將混合液將混合液于3℃-6℃靜置，之后于3℃-6℃離心，棄上清，收集沉淀；

S4.5.重懸提純：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重懸沉淀得到上清液，在所得上清液中緩慢加入緩慢飽和硫酸銨溶液并攪拌，其中上清液和飽和硫酸銨溶液的體積比為（1.8~2.3）：1，將混合液將于3℃-6℃靜置，之后于3℃-6℃離心收集沉淀；

S4.6. 透析濃縮：用PBS溶液洗滌S4.5中得到的沉淀，之后加入PBS溶液重懸沉淀得到沉淀懸濁液，然后沉淀懸濁液經透析和濃縮后得到IHNV卵黃抗體。

2.根據權利要求1所述的虹鱒抗傳染性造血器官壞死病卵黃抗體的制備，其特征在于：所述S1中IHNV滅活疫苗的制備具體過程為：

A1. FHM細胞復蘇：將凍存的FHM細胞置于35℃-38℃下恒溫水浴1-3min，然后再800-1000 r/min 離心4-6 min，去掉上清液，得到復蘇的FHM細胞；

A2. FHM細胞基礎培養：往A1步驟所得的FHM細胞中加入培養基，然后轉移至培養瓶I中培養； 所述培養基中含有體積分數為8%-10%的FBS；

A3. FHM細胞擴大培養：待A2步驟中細胞長滿90%-100%，去掉培養液，用D-PBS漂洗2-3次，然后取濃度為0.20%-0.30%的胰蛋白酶消化貼壁細胞，待1-2分鐘后去掉胰蛋白酶；然后在細胞液中加入培養基，混勻之后將細胞液轉入培養瓶II中，將培養瓶II置于25℃下培養；所述培養瓶II的生長面積是培養瓶I的3-4倍；所述培養基中含有體積分數為8%-10%的FBS；

A4. IHNV病毒培養：待A3步驟中FHM細胞在培養瓶II中長滿90%-100%，去掉培養液，用D-PBS漂洗2-3次，然后加入IHNV毒液，13℃-17℃孵育1 h -2h；之后加入培養基維持液，13℃-17℃培養3-4天，收獲IHNV病毒；所述培養基中含有體積分數為2%-5%的FBS；

A5. IHNV病毒提純：將A4步驟得到的IHNV病毒液置于-80℃~-20℃下凍融，然后將病毒液4000~8000r/min離心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；

A6. IHNV病毒滅活：往A5步驟中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙內酯，直至混合液中β-丙內酯的濃度為0.08-0.1%，3℃-5℃靜置滅活，然后將滅活后的混合液置于36℃-37.5℃恒溫水浴2h-2.5h水解β-丙內酯，最后將水解后的混合液經配制得到IHNV病毒滅活疫苗；其中，所述A1步驟取用的凍存FHM細胞、A2步驟加入的培養基、A3步驟加入的胰蛋白酶、A3步驟加入的培養基、A4步驟加入的培養基維持液的體積比為（1-1.5）：（4-6）：（0.2-1）：（4-6）：（11-13）。