[發明專利]基于qPCR或數字PCR技術用于檢測囊泡中AR-V7及AR的引物及探針

有效

• 申請號: 201810069041.4
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108070641B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 趙立波;孔關義;郭靜雅;李志
• 申請（專利權）人: 北京恩澤康泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明提供一套基于qPCR或數字PCR技術開發的用于檢測囊泡中AR?V7及AR的引物及探針，序列分別如SEQ ID NO:1?6所示。利用所述引物及探針建立了一種基于囊泡的無創、快速、高靈敏度的AR?V7及全長AR的qPCR或數字PCR檢測方法。本檢測方法針對體液標本(包括血液、尿液及前列腺液等)，臨床樣本易獲取，不僅能夠提供用藥指導意見，還能夠對耐藥情況的出現進行反復監控。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術，具體地說，涉及一種基于qPCR 或數字PCR技術用于檢測囊泡中AR-V7及AR的引物及探針。

背景技術

細胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs；以下囊泡均代表細胞外囊泡)是指從細胞膜上脫落或由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles, MVs)和外泌體(exosomes)組成，微囊泡是細胞激活或損傷后從細胞膜脫落的小囊泡。由于細胞外囊泡獨特的生物學特征，其在疾病診斷中有著重要的意義，特別是其中的外泌體。

外泌體是一種由細胞內多泡體與細胞膜融合后分泌到細胞外環境中粒徑介于30～150nm的膜性小囊泡，是細胞間信息傳遞的重要媒介，在抗原呈遞、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤發生發展及轉移過程中發揮了重要作用。其在體液中分布廣泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白質等多種內含物，可以作為腫瘤等多種疾病的無創診斷標志物。

前列腺癌抗雄激素療法中使用恩雜魯胺(AR易位和信號轉導的抑制劑)和阿比特龍(雄激素生物合成的抑制劑)會有耐藥現象的出現。研究表明雄激素受體(AR)剪接變體7信使RNA(AR-V7)與抗雄激素療法耐藥有相關性。

Antonarakis ES(N Engl J Med.2014.)等入組了31例接受恩雜魯胺治療的患者和31例接受阿比特龍治療的前列腺癌患者，對其循環腫瘤細胞中的AR-V7進行檢測，結果顯示，接受恩雜魯胺的患者中，AR-V7陽性患者較陰性患者的PSA(前列腺特異抗原)應答率更低 (0％vs53％，P＝0.004)、PSA無進展生存期更短(中位時間1.4個月 vs.6.0個月；P<0.001)、臨床或影像學無進展生存期更短(中位時間 2.1個月vs.6.1個月；P<0.001)，同時總生存期也更短(中位時間5.5個月vs.未觀察到；P＝0.002)。與之類似，接受阿比特龍治療的患者中 AR-V7陽性患者PSA應答率低于陰性患者(0％vs.68％；P＝0.004)，且PSA無進展生存期更短(中位時間1.3個月vs.未觀察到；P<0.001)、臨床或影像學無進展生存期更短(中位時間2.3個月vs.未觀察到； P<0.001)，并且總生存期也更短(中位時間10.6個月vs.未觀察到； P＝0.006)。結果表明，在去勢抵抗性前列腺癌患者的循環腫瘤細胞中檢測到的AR-V7很可能與恩雜魯胺和阿比特龍的耐藥性有關。

目前尚未有成熟的AR-V7檢測方法，由于僅僅是轉錄本的可變剪切，常規的針對組織樣本免疫組化、fish并不能很好地解決問題，同時前列腺癌癌組織的采集依賴穿刺，是一種有創的方法。上述文獻中利用循環腫瘤細胞(CTC)進行RNA檢測受到CTC本身數目的限制。并不是所有的前列腺癌患者中均能夠采集到CTC，即使能夠檢測到 CTC，大部分樣本中CTC的數目較少，對AR-V7本身的檢測靈敏度較低而且價格昂貴。

因此，亟待開發一種低成本、簡便快速、靈敏的AR-V7檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于qPCR或數字PCR技術用于檢測囊泡中AR-V7及AR的引物及探針、檢測試劑盒。

本發明的另一目的是提供一種基于囊泡的AR-V7檢測方法。

為了實現本發明目的，本發明提供的基于qPCR或數字PCR技術開發的用于檢測囊泡中AR-V7及AR的引物及探針，所述引物和探針分別為(SEQ ID NO:1-6)：