[發(fā)明專利]一種用于培養(yǎng)尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)基

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810067637.0
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108570443A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王淋立;關(guān)春燕;陳月花;李強
• 申請（專利權(quán)）人: 皓昇萊生物制藥有限公司;王淋立
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發(fā)明公開了一種用于培養(yǎng)尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。所述培養(yǎng)基中含有人源血小板裂解物。申請人通過多年來大量地篩查實驗，最終確認(rèn)人源血小板裂解物作為無異源性尿液來源細(xì)胞培養(yǎng)基的核心添加物，可克服以往無異源性培養(yǎng)時所存在的尿液來源細(xì)胞增殖速度極慢并且逐漸發(fā)生細(xì)胞死亡等問題。添加人源血小板裂解物的無異源性培養(yǎng)基并能夠較好地培養(yǎng)尿液來源細(xì)胞，獲得研究或臨床應(yīng)用所需的細(xì)胞量。本發(fā)明血小板裂解物在尿液來源細(xì)胞的無異源性培養(yǎng)及培養(yǎng)基中的應(yīng)用具有創(chuàng)新性，對再生醫(yī)學(xué)具有重大的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種用于培養(yǎng)尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

近年來隨著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的成熟，多種不同類型細(xì)胞均可成功誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞，包括尿液來源細(xì)胞，據(jù)文獻(xiàn)報道，2011年尿液來源細(xì)胞被成功誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞。而尿液來源細(xì)胞相較于其他類型的細(xì)胞提取方法更簡單，只需要收集供體的尿液即可，避免對供體造成疼痛或創(chuàng)傷，因此尿液來源細(xì)胞是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞供體的理想來源。由于尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)是獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，因此，發(fā)展適合臨床級別尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)對再生醫(yī)學(xué)具有極大的推進(jìn)作用。

1972年Southerland和Bain通過收集新生兒尿液并離心進(jìn)而棄除上清獲得少量細(xì)胞沉淀，然后用含30％胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀懸浮，進(jìn)而進(jìn)行培養(yǎng)，首次從尿液中收集培養(yǎng)得到尿液來源細(xì)胞。之后數(shù)十年關(guān)于尿液來源細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到了極大的發(fā)展，然而這些用于培養(yǎng)尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)基都含有胎牛血清或者其它動物源性等異源性成分。除了動物性異源性成分，異源性成分還包括植物源性、微生物源性及真菌源性等非人源物質(zhì)的成分。培養(yǎng)基中所含有的這些異源性成分存在引入外源病毒的風(fēng)險，此外，異源性成分也會成為異源抗原從而引起免疫應(yīng)答，這嚴(yán)重地阻礙了尿液來源細(xì)胞在臨床細(xì)胞治療、臨床再生醫(yī)學(xué)方面等的應(yīng)用。

尿液來源細(xì)胞培養(yǎng)基近年來不斷改進(jìn)，EGF、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、硒、三碘甲狀腺氨酸、視黃酸、氫化可的松、腺嘌呤、B27等在不斷被嘗試加入尿液來源細(xì)胞培養(yǎng)基中來替代動物血清或其他異源物質(zhì)，但實際情況是當(dāng)完全缺乏動物血清或其它異源性成分時，在上述添加物存在下極難或不能獲得我們所需應(yīng)用量的尿液來源細(xì)胞。研究期間通常會發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中尿液來源細(xì)胞增殖速度極慢并且逐漸發(fā)生細(xì)胞死亡，因此要實現(xiàn)完全無異源性尿液來源細(xì)胞的培養(yǎng)仍需要經(jīng)過深入探索和研究。

有實驗數(shù)據(jù)表明，從尿液中收集并成功培養(yǎng)到尿液來源細(xì)胞與尿液樣本的體積、pH值、滲透壓、尿液供體年齡、尿液中的草酸含量、尿液中淀粉酶活性及與尿液在膀胱中存留的時間有相當(dāng)大的聯(lián)系。從1L的尿液中僅可收集到0－6300個尿液來源細(xì)胞，其中大部分樣本可收集到的尿液來源細(xì)胞量少于1000個，而可收集到尿液來源細(xì)胞并存活下來的尿液樣本量僅占所有尿液樣本量的37％。上述獲得足夠尿液來源細(xì)胞的樣本用于培養(yǎng)時，培養(yǎng)條件均為含20％的胎牛血清的培養(yǎng)基，在不含血清的培養(yǎng)基中無法培養(yǎng)得到尿液來源細(xì)胞。即便是利用20％的胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行尿液來源細(xì)胞培養(yǎng)時，收集到的大部分細(xì)胞呈現(xiàn)球狀形態(tài)且無法進(jìn)行貼壁生長，而且貼壁后的細(xì)胞大多為呈現(xiàn)紡錘狀形態(tài)生長的單個細(xì)胞，培養(yǎng)一段時間后大部分只可觀察到1到2個細(xì)胞增殖克隆，并且需要培養(yǎng)接近1個月才可增殖到可傳代的細(xì)胞數(shù)量(R.Belik,W.Follmann,G.H.Degen,P.H.Roos,M.Blaszkewicz,H.J.Knopf,K.Golka,Improvements in culturing exfoliated urothelial cells invitro from human urine,Journal of toxicology and environmental health.Part A,71(2008)923-929.)。