[發明專利]一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201810066746.0
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108220285A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 張哲;傅延;張慧;徐子靜
• 申請（專利權）人: 安徽微分基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，具體提取方法如下：

步驟一：組織樣本：取適量的人或動物組織樣本，并且用剪刀剪碎，轉移至一個干凈的1.5ml離心管，加入30ul Proteinase K(蛋白酶K)和300ul Buffer ATL(緩沖液ATL)，劇烈震蕩10秒使之混勻，再執行步驟二；

步驟二：消化：在步驟一執行之后，溫浴30-60分鐘，溫浴后，如果還有未消化完全的樣本，用吸頭將其挑出丟棄，并且加入300ul AL，迅速震蕩混勻，再執行步驟三；

步驟三：細胞裂解：在步驟二執行之后，將制得的樣本放到掌式離心機上短離1秒，溫浴10分鐘，然后加入600ul Buffer BD(緩沖液BD)和30ul MagBind Particle(粒子)，輕輕緩慢地180°顛倒混勻20-30次，室溫靜置3分鐘，期間輕輕地顛倒混勻數次，然后再將離心管短離0.5秒，再執行步驟四；

步驟四：磁珠結合：在步驟三執行之后，將離心管放到磁力架上，吸附5分鐘，然后將廢液完全吸凈棄掉，再執行步驟五；

步驟五：高鹽溶液洗滌：在步驟四執行之后，加入800ul的BW1 Buffer(緩沖器BW1)，蓋上蓋子，輕輕的180°顛倒磁力架使BW1 Buffer(緩沖器BW1)完全清洗離心管的內部，180°顛倒清洗1分鐘后再靜置1分鐘，然后放到磁力架上吸附3分鐘后吸掉廢液，在吸掉廢液的時候保持離心管在磁力架上，并盡量洗干凈離心管內部的所有廢液，包括管底、管蓋及管壁上的廢液，再執行步驟六；

步驟六：乙醇洗滌：在步驟五執行之后，加入800ul的75％乙醇，蓋上蓋子，輕輕地180°顛倒磁力架使75％乙醇完全清洗離心管的內部，顛倒清洗1分鐘后，然后放到磁力架上吸附3分鐘后吸掉廢液，在吸掉廢液的時候保持離心管在磁力架上，并盡量吸干凈離心管內部的所有廢液，包括管底、管蓋及管壁上的廢液，再執行步驟七；

步驟七：DNA回溶：在步驟六執行之后，將離心管從磁力架上取下，蓋上蓋子，短離3次，每次0.5秒，再將離心管放到磁力架上開蓋吸附2分鐘，吸掉管底的殘留液體，然后開蓋晾干5-10分鐘，再將離心管從磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器輕輕地將吹打磁珠，使之從管壁上剝落至液體里，然后蓋上管蓋，輕彈混勻，放到60℃溫浴5分鐘，溫浴期間，每隔1-2分鐘取出輕彈混勻，將離心管放到磁力架上吸附5分鐘，然后將DNA溶液轉移至新的1.5ml離心管內，分別進行Qubit和FA-50kb kit檢測，再執行步驟八；

步驟八：DNA預存：在步驟七執行之后，提取后的DNA溶液需要在低溫中保存，如果凍存后取用，必須待其室溫溶解后輕彈混勻，不可劇烈震蕩使DNA斷裂。

2.根據權利要求1所述的一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，其特征在于：步驟一中人或動物組織樣本取量為30mg-50mg，剪刀為滅菌后干凈的剪刀。

3.根據權利要求1所述的一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，其特征在于：步驟二中溫浴溫度為55℃，并且在溫浴期間每隔5分鐘取出輕輕地顛倒混勻，迅速震蕩混勻不得超過5秒。

4.根據權利要求1所述的一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，其特征在于：步驟三中溫浴溫度設置為70℃，且溫浴期間每隔3分鐘取出輕輕地緩慢地180°顛倒混勻3-5次，不要進行離心，然后放回繼續溫浴即可。

5.根據權利要求1所述的一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，其特征在于：步驟四中棄掉的廢液通過回收裝置集中回收。

6.根據權利要求1所述的一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，其特征在于：步驟五中所有的動作需要溫柔，且在加液的時候不要碰到磁珠，且步驟五需重復兩次。

7.根據權利要求1所述的一種基于試劑盒的針對人組織中高分子量基因組DNA的提取方法，其特征在于：步驟六中所有步驟重復兩次。