[發(fā)明專利]基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810064006.3
• 申請日: 2018-01-23
• 公開（公告）號: CN107988046B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李娟;龐博;趙超;牟穎;徐坤;宋秀玲;王娟
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/445;C12R1/63
• 代理公司: 長春市東師專利事務(wù)所 22202
• 代理人: 張鐵生

1. 基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片，它包括：進樣層（1）、反應(yīng)層（2）和支撐層（3）；進樣層（1）包括進樣層Ⅰ（11）、防蒸發(fā)膜（8）和進樣層Ⅱ（13），所述的進樣層（1）中心設(shè)有進樣口（4），進樣層Ⅱ（13）設(shè)有若干進樣通道（5）；反應(yīng)層（2）內(nèi)設(shè)有若干反應(yīng)室（6），圓形濾紙片（7）設(shè)在反應(yīng)室（6）內(nèi)；進樣層Ⅰ（11）、進樣層Ⅱ（13）和反應(yīng)層（2）為PDMS材料；進樣口（4）通過進樣通道（5）與反應(yīng)室（6）相通；進樣層（1）上設(shè)有封閉膜（9）；

所述的圓形濾紙片（7）包被了引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片，其特征在于：防蒸發(fā)膜（8）為含氟聚合物Novec。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片，其特征在于：所述的封閉膜（9）為膠帶；支撐層（3）為玻璃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片，其特征在于：所述的反應(yīng)室（6）為2-8個。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片，其特征在于：所述的進樣通道（5）長3~5mm、寬200μm、高115μm；進樣層（1）厚度1.5mm，進樣口（4）的直徑1mm，芯片尺寸為20×20×2.5mm³。

6.權(quán)利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片的制備方法：

1）進樣層的制備

加工進樣通道的陽模，在該陽模上澆注PDMS；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec形成納米級防蒸發(fā)膜；晾干后，再在其表面澆注PDMS，固化；將PDMS和Novec復(fù)合物從陽模上小心揭下，于中心處打孔，制得進樣層；

2)反應(yīng)層的制備

在干凈的硅片上澆注適量PDMS，固化后，揭下；打孔，形成反應(yīng)室，將圓形濾紙片裁剪成放于其中；

3)芯片的組裝

將反應(yīng)層的一側(cè)與玻璃支撐層封接；隨后，反應(yīng)層的另一側(cè)與進樣層的進樣通道側(cè)封接；封接時，要保證進樣通道末端與反應(yīng)室相連。

7.權(quán)利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片的檢測方法，它包括：

1）將引物滴加到圓形濾紙片（7）上，晾干；放入反應(yīng)室（6）中；組裝芯片；

2）使用封閉膜（9）密封進樣口（4）；將芯片置于真空干燥機中，除氣；

3）使用移液器吸取LAMP反應(yīng)液，將吸有反應(yīng)液的吸頭刺入封閉膜（9），在氣壓的驅(qū)動下，反應(yīng)液被自動吸入芯片；隨后，在吸頭內(nèi)的反應(yīng)液液面上方注入密封油；反應(yīng)液完全進入芯片后，密封油也會隨之進入，并封閉進樣通道，從而達到防止反應(yīng)室間交叉污染和防止反應(yīng)液蒸發(fā)的作用；待反應(yīng)液全部進入反應(yīng)室，且密封油充滿進樣通道時，拔去吸頭，重新使用封閉膜（9）封閉進樣口（4）；

4）處理后的芯片放置在加熱板上，60-70℃恒溫反應(yīng)0.5-2小時。

8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌檢測微流控芯片的檢測方法，其特征在于：所述的LAMP反應(yīng)液為8μL，含有如下成分：0.8M甜菜堿，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等溫擴增緩沖液，6 mM 硫酸鎂溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I熒光染料，300 μM 羥基萘酚藍溶液，2.56 U Bst 2.0 熱啟動DNA聚合酶，1.6 μL樣品DNA提取液；

所述的引物為對應(yīng)金黃色葡萄球菌SA特征序列的LAMP引物：

F3-nuc：TGGCTATCAGTAATGTTTCGA

B3-nuc：TTAATTAATGTCGCAGGTTCTT

LF-nuc：GTTAACACTAAGCAACTAG

LB-nuc：CGGCGTAAATAGAAGTGATTCTGAA

FIP-nuc：

GAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGC

BIP-nuc：GCAAATGCATCACAAACAGGTAATTTTAGTTGAAGTTGCACTGTA；

或?qū)?yīng)副溶血性弧菌VP特征序列的LAMP引物，

F3-tlh：AGCTACTCGAAAGATGATCC

B3-tlh：GGTTGTATGAGAAGCGATTG

LF-tlh：ACCAGTAGCCGTCAATG

LB-tlh：TTAGATTTGGCGAACGAGA

FIP-tlh：ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT

BIP-tlh：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG。