[發明專利]陽離子多肽氨基化修飾生物納米磁珠及其制備方法

有效

• 申請號: 201810059469.0
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108220283B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 張金菊;王紅光
• 申請（專利權）人: 北京中科圓融生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/62;C12N15/63;H01F1/00
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;懷春穎

1.一種陽離子多肽氨基化修飾生物納米磁珠，其特征在于，所述陽離子多肽氨基化修飾生物納米磁珠由嫁接有陽離子聚合物的陽離子多肽通過linker與細菌磁顆粒膜蛋白融合表達而成，所述linker的氨基酸殘基為AlaPheAla₂Gly₂Ser(AlaCysGly₂LeuAla)₂(Gly₂Leu₂AlaSer Gly₂Ala₂)₂SerGly₂Ala₂PheAla。

2.如權利要求1所述的陽離子多肽氨基化修飾生物納米磁珠，其特征在于，所述陽離子聚合物為PEI，所述陽離子多肽選自YR-CP1、YR-CP2、YR-CP3或YR-CP4的一種，其中，所述YR-CP1的多肽序列為：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；所述YR-CP2的多肽序列為：CYRQRQTSRRRRRRSCQTQRRAMRCRRRNRLRRRKHRRRYGSRRRRRRYG；所述YR-CP3的多肽序列為：YRVRRSRRRHCSRRRLKRIHRRQRSCRRRKRRSRHRRRHRRGRRKRTCRR；所述YR-CP4的多肽序列為：KNLKKLKKLKCSRRPVRRRRPRVSRKKLKKLSKLVSRRRRRGGRRRCKKL。

3.一種權利要求1所述的陽離子多肽氨基化修飾生物納米磁珠的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

A.構建細菌磁顆粒膜蛋白mamC或mamF的缺失突變體菌株，稱為一級重組菌株；

B.將陽離子多肽通過linker與細菌磁顆粒膜蛋白mamC或mamF融合構建基因表達載體，并將構建的基因表達載體導入到一級重組菌株中，篩選表達陽離子多肽的二級重組菌株；

C.對步驟B獲得的二級重組菌株進行培養發酵，生成表達陽離子多肽的生物納米磁珠；

D.以步驟C獲得的表達陽離子多肽的生物納米磁珠為種子，用陽離子多聚物進行嫁接暴露陽離子多肽表面，形成陽離子多肽氨基化修飾生物納米磁珠。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟A具體步驟為：

A-1：設計兩對引物分別擴增mamC或mamF基因兩側約500bp的同源DNA片段，通過分子克隆構建一條基于噬菌體病毒的微載體序列AAV-del-mamC或AAV-del-mamF；

A-2：AAV-del-mamC或AAV-del-mamF通過質粒提取及酶切步驟得到足夠量的核酸序列產物，調節濃度為2mg/mL，通過電轉化的方式同時轉入MSR-I野生型菌株中；

A-3：電轉化后的MSR-I野生型菌株通過洗脫液梯度洗脫，篩選雙交換突變菌株，經測序技術驗證后，獲得mamC或mamF缺失突變的重組菌株，即一級重組菌株。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟A-2電轉化條件為：方波脈沖，電壓3100V-3200V，電脈沖時間3.1-3.3ms，電脈沖次數1-2次。

6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟A-3所述的洗脫液由如下重量份的成分組成：

蔗糖25-30 慶大霉素10-15 吐溫80 2-3

磷酸鹽緩沖液50-60 磷脂酰乙醇胺5-10。

7.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟B具體步驟為：

B-1：將陽離子多肽的基因序列通過linker與mamC基因或mamF基因進行融合，得到新的融合基因片段；

B-2：將新的融合基因片段克隆到表達載體pBRC上，分別得到基因表達載體；

B-3：通過電轉化的方式分別將基因表達載體導入一級重組菌中，驗證正確后篩選表達陽離子多肽的重組菌株，即二級重組菌株。