[發明專利]一種功能性生物納米磁珠熒光編碼方法及其流式應用

有效

• 申請號: 201810059463.3
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108387729B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 張金菊;王紅光
• 申請（專利權）人: 北京國科融智生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;G01N33/58
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

1.一種對功能性生物納米磁珠進行熒光編碼的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：利用趨磁細菌MSR-I構建細菌磁顆粒膜蛋白基因的缺失突變體菌株，作為一級重組菌株，缺失的所述細菌磁顆粒膜蛋白基因為MamC以及MamF兩種蛋白的基因；

S2：利用任一種缺失的所述細菌磁顆粒膜蛋白基因融合功能蛋白，并通過電轉化的方式導入所述一級重組菌株中，構建二級重組菌株；

S3：利用與步驟S2中不同的任一種缺失的所述細菌磁顆粒膜蛋白基因融合熒光蛋白基因，構建基因融合表達載體；將所述基因融合表達載體通過電轉化的方式導入所述二級重組菌株中，并進行篩選，得到具有熒光編碼特性的三級重組菌株；

S4：對所述三級重組菌株進行培養，得到能同時表達熒光蛋白和功能蛋白的功能性生物納米磁珠；

所述電轉化的具體方法如下：

采用方波電脈沖，在3100～3200V條件下，進行1～2次時長為3.1～3.3ms電脈沖。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1包括如下步驟：S1.1：分別對缺失的兩個所述膜蛋白基因兩側500bp的同源DNA片段進行擴增，通過分子克隆構建兩條微載體；

S1.2：將兩條所述微載體通過電轉化的方式同時轉入MSR-I野生型菌株中；

S1.3：對電轉化后的菌株進行篩選和鑒定，獲得缺失兩種的重組菌株，即為一級重組菌株。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2包括如下步驟：S2.1：將所述功能蛋白的基因序列與一種缺失的所述細菌磁顆粒膜蛋白基因序列進行融合，得到新的融合基因片段；

S2.2：將所述融合基因片段克隆到表達載體pBRC1上，得到功能蛋白表達質粒；

S2.3：通過三親本接合或電轉化的方式將所述功能蛋白表達質粒轉入所述一級重組菌株中，驗證后得到表達所述功能蛋白的重組菌株，即為二級重組菌株。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3的方法如下：S3.1：對所述熒光蛋白基因序列進行PCR擴增；

S3.2：用EcoRI/SmaI對擴增產物和表達載體pBRC2分別進行雙酶切；S3.3：將經過雙酶切的所述擴增產物與不同于步驟S2的缺失的所述細菌磁顆粒膜蛋白基因融合，并連接到同樣經過雙酶切的所述表達載體pBRC2上，得到熒光蛋白表達質粒；

S3.4：通過電轉化的方式將所述熒光蛋白融合表達質粒分別轉化到所述二級重組菌株中，經過篩選驗證得到能表達熒光蛋白的所述三級重組菌株；

S3.5：通過流式細胞儀對所述三級重組菌株表達的不同熒光蛋白進行分析和鑒定。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S4包括如下步驟：S4.1：首先使用200～500mL培養基進行預培養，培養條件為氧氣含量5～10％、N₂含量90～95％，培養時間16小時，培養溫度37℃；

S4.2：將經過預培養的菌株轉接到發酵罐中進行深層培養，培養條件為氧氣含量5％、氫氣含量1％、N₂含量94％，培養時間3～4天，培養溫度37℃；

S4.3：通過均質設備對深層培養物進行處理、將菌體粉碎，通過磁裝置進行吸附，并用磷酸緩沖液洗滌2～3次；

S4.4：用超聲波及蛋白酶緩沖液進行梯度處理，最終得到純化后的功能性生物納米磁珠。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述預培養中使用的培養基包括如下成分：

10～12份牛肉膏、1～2份殼聚糖、1～2份半乳糖、0.5～1份磷酸二氫鈉、0.2～0.5份磷酯酰絲氨酸、0.05～0.1份檸檬酸鈉以及0.5～1份海藻酸鉀；所述深層培養中使用的培養基包括如下成分：

6～8份女貞子多糖、8～12份蛋白胨、1～2份蝸牛多糖、1～2份卵磷脂、0.1～0.2份槲皮素、0.5～1份酒石酸鉀鈉以及0.05～0.1份檸檬酸鈉。