[發(fā)明專利]一種適用于In-Fusion克隆的pGADT7-In載體及其構(gòu)建和使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810057574.0
• 申請(qǐng)日: 2018-01-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108330137B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李成偉;張菊;廖立冰;于德水;張怡;徐克東;劉坤;譚光軒;陳璨;劉霞;韓霄萌;張璇;位張坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 周口師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/66;C12N15/81
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 陳勇

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于In?Fusion克隆的pGADT7?In載體及其構(gòu)建和使用方法。本發(fā)明利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)pGADT7的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造獲得pGADT7?In載體，使pGBKT7和pGADT7?In兩個(gè)載體在被EcoRⅠ酶切后形成的末端含有長(zhǎng)15bp以上相同的序列，進(jìn)一步用In?Fusion技術(shù)進(jìn)行載體構(gòu)建。構(gòu)建一個(gè)給定的基因的誘餌載體或獵物載體只需一對(duì)引物，進(jìn)行一次PCR。將得到的PCR產(chǎn)物和pGBKT7或pGADT7進(jìn)行In?Fusion反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布不同抗性LB平板，用菌落或菌液PCR進(jìn)行鑒定，很容易快速高效完成誘餌載體或獵物載體的構(gòu)建。使用本發(fā)明的pGADT7?In載體和構(gòu)建載體的方法進(jìn)行酵母雙雜交載體構(gòu)建，極大地縮短實(shí)驗(yàn)周期，降低實(shí)驗(yàn)成本，提高成功率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于In-Fusion克隆的pGADT7-In載體及其構(gòu)建和使用方法。

背景技術(shù)

酵母雙雜交是研究蛋白互作的最常用的方法，常常用于已知蛋白之間的互作驗(yàn)證和已知蛋白互作的蛋白的篩選。以常用的GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)為例，酵母雙雜交技術(shù)包含兩個(gè)載體，分別含有轉(zhuǎn)錄因子GAL4的激活結(jié)構(gòu)域(AD)和轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)。使目的基因a和AD融合表達(dá)的載體稱之為獵物載體，使目的基因b與BD融合表達(dá)的載體稱之為誘餌載體。當(dāng)目的基因a和目的基因b有相互作用時(shí)，GAL4的AD空間上接近BD，可以激活報(bào)告基因的表達(dá)，看到的結(jié)果是酵母在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和變藍(lán)。

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的第一步，也是關(guān)鍵的一步，是酵母雙雜交載體的構(gòu)建。載體構(gòu)建的傳統(tǒng)方法是酶切和連接，包含對(duì)目的DNA片段和載體的切割回收以及后續(xù)兩者的連接。該方法過(guò)程繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，且常常受制于載體和插入基因上的酶切位點(diǎn)，成功率不高。Gateway技術(shù)是Invitrogen已經(jīng)商業(yè)化的技術(shù)，它是基于噬菌體的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，在目的片段添加重組位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物與含重組位點(diǎn)的供體載體混合進(jìn)行BP反應(yīng)獲得入門載體(entry clone)，入門載體可以和不同用途的目標(biāo)載體進(jìn)行LR反應(yīng)獲得相應(yīng)的表達(dá)載體，不依賴于酶切位點(diǎn)。有一些酵母雙雜交載體通過(guò)改造可以利用Gateway技術(shù)進(jìn)行載體構(gòu)建。但是Gateway技術(shù)需要兩步反應(yīng)，而且起始PCR的引物需要包含30bp左右的attB位點(diǎn)，長(zhǎng)的引物增加了PCR的難度和合成引物的成本以及引物合成中帶來(lái)突變的概率，同時(shí)Gateway技術(shù)所用的酶比較貴。有研究者利用兩輪PCR結(jié)合長(zhǎng)引物的方法在目的基因兩端融合attL的位點(diǎn)，繞過(guò)了BP反應(yīng)，直接一步進(jìn)行Gateway的LR反應(yīng)進(jìn)行載體構(gòu)建，這種方法需要兩輪PCR反應(yīng)，增加了PCR的復(fù)雜性和突變的概率。

近些年發(fā)展起來(lái)的In-Fusion克隆技術(shù)是一種更為方便的載體構(gòu)建技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)DNA片段無(wú)縫連接，完全不依賴于限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，只需要最少15min就可以將DNA片段連接到任何載體中。In-Fusion克隆技術(shù)已經(jīng)由Clontech公司開(kāi)發(fā)出商業(yè)化的試劑盒，在相關(guān)酶的作用下，識(shí)別DNA片段和線性化載體末端不少于15bp的重組臂序列，進(jìn)而將DNA片段整合入載體中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了傳統(tǒng)載體構(gòu)建過(guò)程中需進(jìn)行的酶切和連接的繁瑣步驟及酶切位點(diǎn)的限制、Gateway技術(shù)需要較長(zhǎng)引物起始和兩輪反應(yīng)耗時(shí)較長(zhǎng)、改進(jìn)后的Gateway技術(shù)需要兩輪PCR的缺點(diǎn)。本發(fā)明首先利用定點(diǎn)突變技術(shù)(Site-directed mutagenesis)對(duì)獵物載體pGADT7的多克隆位點(diǎn)(Multiple Cloning Site,MCS)進(jìn)行改造，提供了一種適用于In-Fusion克隆的pGADT7-In載體，所述pGADT7-In載體是由pGADT7載體定點(diǎn)突變獲得，pGADT7-In載體和pGBKT7載體上多克隆位點(diǎn)中EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的上下游具有一段長(zhǎng)15bp以上的相同序列。

進(jìn)一步地，所述pGADT7-In載體和pGBKT7載體上多克隆位點(diǎn)中EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的下游具有一段長(zhǎng)15bp的相同序列，該序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ IDNO.2所示。