[發明專利]利用抗病基因識別無毒效應蛋白以鑒定具有分泌功能信號肽的方法

有效

• 申請號: 201810055476.3
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108359689B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 陰偉曉;羅朝喜;謝松霖;林楊;田振東
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/31;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供了一種利用抗病基因識別無毒效應蛋白以鑒定具有分泌功能信號肽的方法，包括以下步驟：(1)將待鑒定信號肽連接致病疫霉無毒效應蛋白Avr3a的C端構建表達載體，所述致病疫霉無毒效應蛋白Avr3a的C端氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；(2)將步驟(1)構建的表達載體轉化感受態細胞；(3)將步驟(2)的感受態細胞和含有抗病基因的感受態細胞共同注射入植物細胞中，觀察注射位點壞死情況，若注射位點壞死，則待檢測信號肽不具有分泌功能，若注射位點無壞死，則待檢測信號肽具有分泌功能。

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體地說，涉及一種利用抗病基因和無毒效應蛋白在細胞內識別并引起細胞壞死的特點來鑒定具有分泌功能信號肽的方法。

背景技術

分泌蛋白指的是在細胞內合成，能夠分泌到細胞外發揮作用的蛋白質。信號肽位于分泌蛋白的N端，一般由15-30個氨基酸組成。當信號肽序列合成后，被信號識別顆粒所識別，蛋白質合成暫停或減緩，信號識別顆粒將核糖體攜帶至內質網上，蛋白質合成重新開始。在信號肽的引導下，新合成的蛋白質進入內質網腔，最終被轉移到細胞外，信號肽則被切除。

植物病原菌分泌的無毒效應蛋白進入寄主植物細胞后，能夠被對應的抗病基因識別，引起植物細胞壞死。目前，植物病原細菌、真菌以及卵菌中大量的無毒效應蛋白和對應的抗病基因已經被鑒定。例如，卵菌中致病疫霉的無毒效應蛋白Avr3a和寄主中對應的馬鈴薯抗病基因R3a已經被鑒定，R3a在植物細胞中可以識別Avr3a，引起細胞壞死。由于R3a在植物細胞中發揮作用，對Avr3a的識別也發生在細胞內，因此Avr3a在植物細胞外時則不能被識別，從而不能引起細胞壞死。

當前，檢測分泌信號肽功能的方法有酵母的pSUC2系統、分泌蛋白融合標簽后在病原菌中超量表達后進行檢測等。酵母系統需要進行酵母轉化，并且在多種培養基上驗證，操作過程繁瑣，費用高。在病原菌中超量表達融合有標簽蛋白的分泌蛋白，需要進行病原菌的轉化，效率較低，周期長，并且費用較高。現有技術亟需一種操作簡單、成本低、準確率高、效率高且耗時短的檢測具有分泌功能信號肽的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種成本低、準確率高、成本低、耗時短的鑒定信號肽是否具有分泌功能的方法。本發明利用Avr3a和R3a在植物細胞內識別引起細胞死亡的特點，在本氏煙中表達R3a以及融合檢測信號肽的Avr3a，觀察其是否可以引起壞死，可以快速高效的檢測信號肽是否具有分泌功能。

本發明提供了一種利用抗病基因識別無毒效應蛋白以鑒定具有分泌功能信號肽的方法，所述抗病基因能夠在細胞內識別無毒效應蛋白，包括以下步驟：

(1)將待鑒定信號肽連接無毒效應蛋白C端構建表達載體；

(2)將步驟(1)構建的表達載體轉化感受態細胞；

(3)將步驟(2)的感受態細胞和含有抗病基因的感受態細胞共同注射入植物細胞中，觀察注射位點壞死情況，若注射位點壞死，則待檢測信號肽不具有分泌功能，若注射位點無壞死，則待檢測信號肽具有分泌功能。

所述抗病基因為R3a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述無毒效應蛋白為致病疫霉無毒效應蛋白Avr3a，其C端核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

步驟(1)所述表達載體為植物瞬時表達載體。

步驟(2)所述感受態細胞為農桿菌感受態。

步驟(3)所述植物為煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒。

本發明提供的利用抗病基因識別無毒效應蛋白以鑒定具有分泌功能信號肽的方法還包括設立陽性對照，所述陽性對照是在步驟(1)階段，將大豆疫霉無毒效應蛋白Avr1b的信號肽連接無毒效應蛋白C端構建表達載體得到。