[發(fā)明專(zhuān)利]一種人凝血因子VIII的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810054781.0
• 申請(qǐng)日: 2018-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108218981B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳云華;陳艾軍;向宏;王勇;符平松;趙學(xué)梅;劉欣晏;楊剛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 貴州泰邦生物制品有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/755
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/755;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/16
• 代理公司: 52114 貴陽(yáng)睿騰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 周黎亞

1.一種人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)冷沉淀制備：制備血漿冷沉淀；

2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；

3)酸沉淀：用醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH，并降溫至14℃ ± 2℃，酸沉淀后離心收集上清液，出液溫度15± 5℃，離心機(jī)出液速度≤5000ml/min；

4)DEAE Sephadex A-50凝膠吸附：將步驟3)得到的上清液中加入DEAE Sephadex A-50凝膠吸附，吸附后離心收集上清液；DEAE Sephadex A-50凝膠的用量為每份血漿冷沉淀干膠用量為0.0025份；

5)S/D病毒滅活：將步驟4)得到的上清液用S/D滅活劑進(jìn)行滅活，使制品聚山梨酯80的量為1± 0 .3％g/g，磷酸三丁酯的量為0 .3± 0 .1％g/g，制品蛋白濃度≤50mg/ml，滅活溫度24± 1℃，滅活時(shí)間為6h；

6)TOYOPEARL DEAE-650M凝膠柱層析：柱平衡液沖洗5-6個(gè)柱體積，將步驟5)得到的滅活液進(jìn)行上樣，洗滌液洗滌至基線平穩(wěn)，洗脫液洗脫，收集洗脫峰，得洗脫液；

7)超濾：步驟6)得到的洗脫液進(jìn)行濃縮，得濃縮液，濃縮液用透析液進(jìn)行6-7倍體積透析，最后一次透析完后濃縮至人凝血因子Ⅷ 效價(jià)為30IU/ml以上；

8)半成品制備：將步驟7)得到的人凝血因子Ⅷ 溶液，按出品規(guī)格用超濾透析液進(jìn)行配制，制品pH為7 .0± 0.5，除菌過(guò)濾；

9)成品制備：將步驟8)得到的人凝血因子Ⅷ 溶液進(jìn)行分批、分裝，凍干，壓塞出柜，干熱病毒滅活，包裝既得；

所述的制備血漿冷沉淀，其循環(huán)水溫度為28℃，攪拌速度為95r/min，離心轉(zhuǎn)速為13800r/min，出液溫度為2℃，進(jìn)液速度為3.3kg/min；

所述的冷沉淀溶解，肝素鈉的注射用水溶液加入量為沉淀的4 .1倍，溶解溫度為11℃，溶解時(shí)間為1 .8h，用醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7 .0，繼續(xù)溶解30min；

所述的柱平衡液，其為90mmol/L氯化鈉，10mmol/L枸櫞酸鈉，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化鈣，pH 6 .9-7 .1，溫度15± 5℃；

所述的洗滌液 ，120mmol/L氯化鈉，10mmol/L枸櫞酸鈉，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化鈣；pH 6 .9-7 .1，溫度15± 5℃；

所述的洗脫液 ，200mmol/L氯化鈉，20mmol/L枸櫞酸鈉，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化鈣；pH 7 .0，溫度15± 5℃；

所述的透析液 ，50mmol/L氯化鈉，6mmol/L枸櫞酸鈉，1mmol/L氯化鈣，6 .7g/L白蛋白，35g/L鹽酸精氨酸，pH7 .0± 0.5；

所述的凍干，隔板溫度降至-45℃，并保持3 .6h；擱板溫度2 .5h升溫至-30℃，保持13h；隔板經(jīng)32h升溫至0℃，保持13 .7h；擱板溫度4h升溫至30℃，保溫11 .5小時(shí)；其中在冷凍干燥和解析干燥過(guò)程中真空度不大于30Pa；

所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液；

所述TOYOPEARL DEAE-650M凝膠柱層析，其柱子高20cm，層析流速為110cm/h。