[發明專利]一種釀酒酵母發酵生產丙烯酸的方法

有效

• 申請號: 201810051564.6
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108004274B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 卓炳照;胡欣;李棋;林煒鋒;江會鋒;王文
• 申請（專利權）人: 嘉興欣貝萊生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/40
• 分類號: C12P7/40;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 重慶中之信知識產權代理事務所(普通合伙) 50213
• 代理人: 馬晨博

1.一種釀酒酵母發酵生產丙烯酸的方法，其特征在于，以丙三醇為原料，釀酒酵母菌為宿主菌，經過宿主菌體內若干酶的催化而完成；

所述宿主菌按下述方法構建獲得：

1)根據釀酒酵母密碼子偏好性優化基因GlyDH和DAK的密碼子，然后利用雙向啟動子，將兩個基因構建于釀酒酵母表達載體YCplac33，得到載體1，表達載體YCplac33帶有大腸桿菌的氨芐霉素抗性和釀酒酵母的篩選標記URA基因；

2)依據釀酒酵母密碼子偏好性對ceaS2基因及NOX基因進行優化，然后將兩個基因同時構建于釀酒酵母表達載體YCplac33，得到載體2，表達載體YCplac33帶有大腸桿菌的氨芐霉素抗性基因和釀酒酵母的篩選標記Leu基因；

3)敲除釀酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到經過改造的釀酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；

4)將上述載體1和2同時轉入3)中所描述的經過改造的釀酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根據釀酒酵母的篩選標記ura和Leu基因，篩選陽性克隆，然后提取釀酒酵母基因組，進一步PCR驗證。

2.根據權利要求1所述的釀酒酵母發酵生產丙烯酸的方法，其特征在于，步驟1)中GlyDH和DAK基因分別根據嗜熱脂肪土芽孢桿菌和畢赤酵母中相應基因的氨基酸序列來合成。

3.根據權利要求1所述的釀酒酵母發酵生產丙烯酸的方法，其特征在于，步驟2)中ceaS2和NOX基因分別根據棒狀鏈霉菌和嗜熱脂肪土芽孢桿菌相應基因的氨基酸序列來合成。

4.根據權利要求1所述的釀酒酵母發酵生產丙烯酸的方法，其特征在于，所述合成方法步驟如下：

1)根據釀酒酵母密碼子偏好性優化基因GlyDH和DAK的密碼子，然后利用雙向啟動子，將兩個基因構建于釀酒酵母表達載體YCplac33，得到載體1，表達載體YCplac33帶有大腸桿菌的氨芐霉素抗性和釀酒酵母的篩選標記URA基因；

2)依據釀酒酵母密碼子偏好性對ceaS2基因及NOX基因進行優化，然后將兩個基因同時構建于釀酒酵母表達載體YCplac33，得到載體2，表達載體YCplac33帶有大腸桿菌的氨芐霉素抗性基因和釀酒酵母的篩選標記Leu基因；

3)敲除釀酒酵母BY4741中的PDC1基因、DLD1基因、GPD1基因和GPD2基因，得到經過改造的釀酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2菌株；

4)將上述載體1和2同時轉入3)中所描述的經過改造的釀酒酵母BY4741-ΔPDC1-ΔDLD1-ΔGPD1-ΔGPD2中，根據釀酒酵母的篩選標記ura和Leu基因，篩選陽性克隆，然后提取釀酒酵母基因組，進一步PCR驗證；

5)將釀酒酵母宿主菌培養，誘導表達；

6)在表達后的菌液中添加甘油底物，繼續反應20-60h；

7)將反應液中的丙烯酸提取、分離純化。

5.根據權利要求4所述的釀酒酵母發酵生產丙烯酸的方法，其特征在于，步驟6)中甘油的添加量為：10g/L-100g/L，反應溫度為：25-35℃。