[發明專利]一種基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法

在審

• 申請號: 201810050784.7
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108118090A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 陳尚海;張亮;曾小虎;徐鵬;余盛;劉顯波
• 申請（專利權）人: 成都市房屋安全事務中心
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 何紅信

1.一種基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、選取在形態分類上鑒定準確且與模式標本核對過的白蟻樣本為模板，提取樣本DNA，選擇線粒體COI為特征片段，進行PCR擴增和Sanger測序，獲得相應序列，從而建立白蟻樣本DNA條形碼數據庫；

B、采集待測白蟻樣本，提取樣本DNA，選擇線粒體COI為特征片段進行PCR擴增和Sanger測序，獲得待測白蟻特征片段序列；

C、將步驟B獲得的待測白蟻特征片段序列與步驟A建立的DNA條形碼數據庫進行比對，判斷白蟻種類。

2.根據權利要求1所述的基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于，所述步驟A和B中，提取樣本DNA采用試劑盒法進行抽提。

3.根據權利要求2所述的基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于，所述采用試劑盒法進行抽提具體包括如下過程：

D1、取待試驗的白蟻樣本，剔除腹部，留下頭部和胸部，用蒸餾水漂洗干凈，然后置于2mL的Eppendorf管中；

D2、向Eppendorf管中加入200μL緩沖液GA；

D3、向Eppendorf管中加入20μL蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，置于56℃水浴鍋2-3小時，期間間歇性振蕩；

D4、向Eppendorf管中加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，待溶液變清亮，離心去除管蓋內壁的水珠；

D5、向Eppendorf管中加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，離心去除管蓋內壁的水珠；

D6、將步驟D5所得溶液加入吸附柱中，離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；

D7、向吸附柱中加入500μL緩沖液GD，離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

D8、向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

D9、重復操作步驟D7；

D10、將吸附柱放回收集管中，離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫放置2-9分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

D11、將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，離心2分鐘，將溶液收集到離心管中，于零下20℃保存備用。

4.根據權利要求3所述的基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于：所述步驟D6、D7、D8、D10和D11中離心時轉速控制為11000-13000轉/分鐘。

5.根據權利要求1所述的基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于：所述步驟A和B中，線粒體COI特征片段的擴增通用引物序列為：

COI-F:CTTCGTATTTGGTGCATGAT；

COI-R:CWGGGTCRAAGAATGATGTA。

6.根據權利要求1所述的基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于，步驟A和B中，所述的PCR擴增的反應條件為：98℃預變性2min，循環反應35次；每一循環包含98℃10s，56℃10s，72℃30s，72℃延伸3min，4℃保存。

7.根據權利要求1所述的基于DNA條形碼的白蟻快速分類鑒定方法，其特征在于：所述步驟A和B中，采集的白蟻樣本用質量分數為75％的酒精浸泡于5ml離心管中。