[發明專利]一種利用α-溶血素納米孔檢測DNA糖基化酶活性的方法

有效

• 申請號: 201810050228.X
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108192948B
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 郗冬梅;尚積禎;王瑩;李志;劉麗萍
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;G01N27/447
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 徐明雙

本發明公開了一種利用α?溶血素納米孔檢測DNA糖基化酶活性的方法。該方法設計一個部分互補的雙鏈DNA作為DNA糖基化酶hOGG1的底物，然后將該雙鏈DNA固定在鏈霉親和素磁珠表面，形成雙鏈DNA?磁珠復合物作為探針。DNA糖基化酶hOGG1存在時，能夠特異性識別雙鏈DNA底物探針上的損傷堿基8?氧鳥嘌呤，將該損傷堿基切除，并且切斷DNA的骨架。本發明利用α?溶血素納米孔檢測該輸出DNA，所產生阻斷信號的頻率與hOGG1的活性呈正相關。因此可以用來檢測DNA糖基化酶hOGG1的活性，具有高靈敏度、高效率、免標記、免擴增的優點。

技術領域

本發明屬于生化分析技術領域，具體涉及一種利用α-溶血素納米孔檢測DNA糖基化酶活性的方法。

背景技術

維持基因組DNA的完整性對于保持物種的穩定具有十分重要的意義，然而基因組DNA不可避免地收到體內外各種因素的影響，如輻射、化學誘變劑、活性氧(ROS)等。在各種各樣的DNA損傷中，8-氧橋鳥嘌呤(8-oxoG)是一種比較常見的氧化損傷，通常由暴露在細胞內的活性氧(ROS)導致產生。這種氧化損傷如果不進行及時修復，會導致一系列DNA結構的變換。而且，8-氧橋鳥嘌呤在DNA復制過程中能夠和A堿基發生錯配，誘導G:C堿基配對向A:T配對的突變，進一步導致多種癌癥的發生。人體內，人8-氧橋鳥嘌呤DNA糖基化酶(human 8-oxoguanine DNA glycosylase，hOGG1)是一種專門用于修復DNA損傷8-氧橋鳥嘌呤的堿基修復酶。hOGG1能夠特異性識別雙鏈DNA中的oxoG：C堿基對，將損傷的oxoG堿基從DNA中切除，進一步切斷DNA的骨架，然后在聚合酶和連接酶作用下完成受損DNA的修復。DNA糖基化酶hOGG1的異常表達與很多疾病密切相關，如肺癌、乳腺癌、胃癌、膽囊癌、膀胱癌、帕金森病。因此，發展一種高靈敏、高特異性檢測DNA糖基化酶hOGG1的方法對于疾病的早期診斷具有重要意義。

傳統檢測DNA糖基化酶hOGG1的方法主要包括凝膠電泳(gelelectrophoresis)、放射性標記(radiolabeling)、高效液相色譜分析(HPLC)以及質譜分析(MS)。這些檢測方法十分有效，但是非常耗時，操作繁瑣，而且存在安全隱患。

為了克服以上缺點，近年來也發展了以納米技術為基礎的比色檢測法以及熒光染料為基礎的熒光探針檢測法，如CN105755101A公開了一種基于單個量子點水平檢測DNA糖基化酶活性的方法，檢測時，DNA糖基化酶hOGG1會特異性識別并切除損傷鳥嘌呤，留下一個脫堿基位點，脫嘌呤核酸內切酶-1(APE1)會對脫堿基位點進一步剪切，留下一個核苷酸的缺口，DNA聚合酶β將三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(Cy5-dGTP)聚合在該缺口處，生成雙標記的雙鏈核苷酸底物，通過生物素與鏈霉親合素之間的特異性反應，DNA底物會結合在覆蓋有鏈霉親和素的量子點表面，形成量子點-DNA-Cy5復合物，空間距離縮小，導致量子點和Cy5之間發生熒光共振能量轉移，從而可以在單分子水平觀察到Cy5的熒光信號，實現了hOGG1的快速、靈敏檢測；CN104630363A公開了一種基于免標記無酶DNA機器熒光放大策略檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的方法，利用包含尿嘧啶堿基和引發序列的雙鏈DNA探針識別UDG目標物并釋放引發鏈，該引發鏈可激活免標記無酶的DNA機器，產生放大的熒光信號，由于雙鏈DNA探針及G-四聯體的設計，檢測方法成功實現了背景降低和信號放大，UDG活性的檢測限為0.00044U/mL。以上方雖然有效，但是納米顆粒的處理較為麻煩，耗時長，操作復雜，而且必須進行熒光標記和信號的循環放大才能達到較高的靈敏度。

近年來，納米孔傳感技術因其快速、低成本、無需標記等優點，在化學和生物等諸多研究領域得到廣泛應用，已發展成為一種新穎的、獨具特色的單分子分析手段。由于單個待測分子在納米通道中的物理占位作用等，改變了通道的電阻，從而引發流經納米通道的離子電流發生變化，形成阻斷電流信號。離子流阻斷程度和阻斷時間等信號可反映分子的序列、結構特征等信息，信號頻率可反映分子的濃度。將納米孔技術應用于生物標志物的超靈敏檢測，可實現對疾病的早期診斷和治療，在臨床醫學領域具有廣闊的應用前景。