[發明專利]一種雙芽巴貝斯蟲巢式PCR特異性引物及檢測試劑盒與巢式PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201810048165.4
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108034741A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 王素華;帥江冰;張曉勇;呂繼洲;袁淑輝;吳紹強;張曉峰
• 申請（專利權）人: 王素華
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙) 33237
• 代理人: 王堅強

1.一種雙芽巴貝斯蟲巢式PCR特異性引物，其特征在于，包括設計的兩對特異性引物，具體為：

外引物BF1：5＇-CAT-CTA-ATT-TCT-CTC-CAT-ACC-CCT-CC-3′；

內引物BR1：5＇-CCT-CGG-CTT-CAA-CTC-TGA-TGG-CAA-AG-3′；

外引物BF2：5′-CGC-AAG-CCC-AGC-AGG-CCC-CGG-TGC-3′；

內引物BR2：5′-CCG-ACC-TGG-ATA-GGC-TGT-GTC-ATG-3′。

2.一種雙芽巴貝斯蟲巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的巢式PCR檢測試劑盒包括以下組分：

(一)權利要求1所述的兩對特異性引物；

(二)陽性對照：所述的陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，該質粒含雙芽巴貝斯蟲405bp基因片段；

(三)陰性對照：所述的陰性對照為去離子水；

(四)Taq酶。

3.根據權利要求2所述的雙芽巴貝斯蟲巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照通過將擴增產物克隆至pUCm-T轉化DH5-α感受態細胞，經酶切鑒定及測序后獲得為陽性重組質粒的陽性對照。

4.一種采用權利要求1所述的特異性引物的雙芽巴貝斯蟲巢式PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)被檢標本DNA提?。喝∥⑿∨ｒ绾蜕阮^蜱數只，酒精清洗，每只蜱放入單獨的1.5mlEP dof管，200μL PBS液浸沒小牛蜱和扇頭蜱，用樣品破碎儀破碎蜱的蟲體，吸取破碎后的溶液，加入Trizol試劑裂解，采用常規的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存備用；

(2)以權利要求1中的外引物BF1、BR1擴增：在EP dof管中加入處理后的蜱標本DNA，同時設陰、陽性對照，10×PCR Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶，25pmol/μL BF1，25pmol/μL BR1，DNA模板，ddH2O混勻后稍離心的50μL反應體系中進行第一輪PCR；

(3)以權利要求1中的內引物BF2、BR2擴增：以第一輪PCR產物DNA為模板，以BF2、BR2為第二套引物，在10×PCR Buffer 5μL，Mgcl2 2μL，dNTP 4μL，Taq酶0.5μL，25pmol/μL BF2 1μL，25pmol/μL BR2 1μL，DNA模板2μL，ddH2O 34.5μL混勻后稍離心的50μL反應體系進行第二輪PCR；

(4)PCR產物鑒定：取第二輪PCR產物2μL進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

(5)測序：將第二輪PCR產物送測序公司進行序列測定。

5.根據權利要求4所述的雙芽巴貝斯蟲巢式PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的第一輪PCR反應條件為：

95℃預熱5min；

95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，該步驟進行共30個循環；

末次延伸至72℃，保持10min。

6.根據權利要求4所述的雙芽巴貝斯蟲巢式PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的第二輪PCR反應條件為：

95℃預熱5min；

95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，該步驟進行共30個循環；

末次延伸至72℃，保持10min。