[發(fā)明專利]一種立克次氏體巢式PCR特異性引物及檢測試劑盒與巢式PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810048122.6
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108034738A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發(fā)明（設計）人: 王素華;帥江冰;張曉勇;呂繼洲;袁淑輝;張曉峰;吳紹強
• 申請（專利權）人: 王素華
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙) 33237
• 代理人: 王堅強

一種立克次氏體巢式PCR特異性引物及檢測試劑盒與巢式PCR檢測方法，本方法的模板DNA制備步驟簡單費用低，本方法檢測非常方便快捷，并能提高檢測方法的特異性及敏感性，單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定，針對立克次氏體的pCS20為靶基因的特異性區(qū)域，設計4條特異性引物，解決了現(xiàn)有PCR檢測技術低特異性和低敏感性，擴增時容易產生假陽性、蜱蟲體內立克次氏體含量較低時容易漏檢的缺陷，本發(fā)明方法反應特異性更強、敏感性更高，該方法專用于立克次氏體精準檢測，應用前景廣闊。

技術領域

本發(fā)明具體涉及生物學技術領域，具體涉及一種立克次氏體巢式PCR特異性引物及檢測試劑盒與巢式PCR檢測方法。

背景技術

立克次氏體是一類依賴于宿主細胞和專性細胞內寄生的小型革蘭氏陰性原核單細胞微生物，介于細菌和病毒之間，較接近于細菌。由立克次氏體引起的疾病統(tǒng)稱立克次氏體病，是一種人畜共患的自然疫源性疾病，人被感染立克次氏體的媒介昆蟲叮咬或接觸其糞便可被感染。該病在歷史上曾經嚴重威脅人類健康，造成災難，目前已成為世界性關注的疾病。人類立克次氏體病的傳染源主要是感染的家畜，特別是牛和羊。在動物之間，該病原體以蜱為傳播媒介進行傳播并可以經卵傳代，從而形成自然疫源地。動物感染立克次氏體后多呈亞臨床經過，但綿羊和山羊有時出現(xiàn)食欲不振，體質量下降，產奶量減少和流產、死胎等現(xiàn)象；牛可出現(xiàn)不育和散在性流產。立克次氏體的臨床診斷主要的方法是直接鏡檢、血清學診斷(酶聯(lián)免疫吸附實驗和間接免疫熒光試驗)、常規(guī)PCR檢測及病原分離等。直接鏡檢只能用于對發(fā)病動物的檢測，但對疫病普查和進出口檢疫則有困難。血清學診斷主要是間接免疫熒光分析，但是此方法敏感性不高。敏感性更高的方法，例如常規(guī)PCR檢測技術也是診斷寄生在蜱體內的立克次氏體最常用的方法，但是該方法具有很大的一個缺點一低特異性和低敏感性，擴增時容易產生假陽性、蜱蟲體內立克次氏體含量較低時容易漏檢。巢式PCR使用兩套引物通過兩輪PCR反應擴增靶基因DNA片段，第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似，第二對引物結合在第一次PCR產物內部，反應特異性強、敏感性高。巢式PCR檢測技術已廣泛應用于病原體檢測。

發(fā)明內容

為了解決現(xiàn)有技術的缺陷及不足本發(fā)明提供了了一種立克次氏體巢式PCR特異性引物及檢測試劑盒與巢式PCR檢測方法，建立一種精準、高效、實用的DNA檢測方法。針對立克次氏體的pCS20為靶基因的特異性區(qū)域，設計4條特異性引物，提供了一種立克次氏體的巢式PCR特異性引物及檢測試劑盒與巢式PCR檢測方法，可用于立克次氏體病精準檢測，應用前景廣闊，該方法可用于雙芽巴貝斯蟲病流行病學調查及快速檢測。

本發(fā)明采用的技術解決方案是：一種立克次氏體巢式PCR特異性引物，包括設計的兩對特異性引物，具體為：

外引物EF1∶5′-TTT-CCC-TAT-GAT-ACA-GAA-GGT-AAC-3′；

內引物ER1：5′-AAA-GCA-AGG-ATT-GTG-ATC-TGG-ACC-3′；

外引物EF2：5′-ACT-AGT-AGA-AAT-TGC-ACA-ATC-TAT-3′；

內引物ER2：5′-TGA-TAA-CTT-GGT-GCG-GGA-AAT-CCT-T-3″。

一種立克次氏體巢式PCR檢測試劑盒，所述的巢式PCR檢測試劑盒包括以下組分：

(一)權利要求1所述的兩對特異性引物；

(二)陽性對照：所述的陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，該質粒含立克次氏體993bp基因片段；

(三)陰性對照：所述的陰性對照為去離子水；

(四)Taq酶。

所述的陽性對照通過將擴增產物克隆至pUCm-T轉化DH5-α感受態(tài)細胞，經酶切鑒定及測序后獲得為陽性重組質粒的陽性對照。