[發明專利]一種無血清馴化培養人間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201810047983.2
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108642002A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 劉馨;馬波
• 申請（專利權）人: 劉馨
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61K9/08;A61P43/00;A61P37/06;A61P37/02;A61P9/00;A61K8/99;A61Q19/00;A61Q7/00;A61Q19/02;A61Q19/08
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本發明公開了一種無血清馴化培養人間充質干細胞的方法。該方法使人胎盤來源的間充質干細胞適應至體外的無血清培養體系，并獲得了與有血清培養相似的細胞密度和活率，與現有的人間充質干細胞培養方法相比，更經濟、更有效。采用此方法，與血管生長相關的bFGF、PDGF、VEGF表達量比未馴化細胞有所上升。馴化后的細胞可以用于靜脈注射的干細胞制劑制備；所馴化細胞的分泌活性因子成分可用作面膜、眼膜、發膜的組分。

技術領域

本發明涉及一種人間充質干細胞的培養方法，更具體地說，本發明涉及利用一種獨特、安全的馴化培養方式達到人間充質干細胞的無血清體外培養。

背景技術

干細胞是人體細胞的祖先，我們體內的所有細胞均來自于干細胞。當體內的細胞衰老死亡或者損傷變性時，干細胞就會生長和轉變出可以替代它們的細胞。作為種子細胞,臨床上主要用于治療機體無法自然修復的組織細胞和器官損傷的多種難治性疾病；作為免疫調節細胞，治療免疫排斥和自身免疫性疾病。人間充質干細胞（human mesenchymal stemcells, HMSC）是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層，屬于多能干細胞，MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。最初的臨床研究是1995年由Lazarus等人進行的，他們收集緩解期血液腫瘤患者的自體MSC，在體外擴增培養4~7周，然后再靜脈注射入患者體內，患者被分為3組，分別給予不同劑量的MSC，注射后沒有觀察到毒副作用，提示MSC用于移植治療安全可靠。隨后自體MSC的臨床報道逐漸增多，病種涉及放療及化療后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心臟系統疾病等，在這些報道中均證明臨床經靜脈輸注安全可靠。間充質干細胞的體外培養工藝是關系到干細胞作為藥物或者美容產品使用安全性的關鍵步驟。培養工藝中尤其是培養基的成分是主要的影響參數。現在普遍采用的培養方法有常規的加牛血清的培養方法和無血清培養方法兩種。血清培養的方法較為簡單，細胞生長狀態較好，主要質控對象是血清，但因為加入的血清比例在10-20%之間，存在較大的牛血清蛋白殘留的問題。在檢索到的專利（包括授權和公開未授權）中，間充質干細胞的培養主要采用DMEM的完全培養基。專利C12N5/0775(2006.01)I提到一種擴增未分化的間充質干細胞(MSC)的方法，其包括：在包含煙酰胺和成纖維細胞生長因子4(FGF4)的培養基中培養未分化的MSC，其中所述培養基沒有另外添加其它生長因子和/或分化因子，從而產生未分化的MSC擴增細胞。無血清培養基雖然成分清晰，但是成本高昂，而且存在干細胞的生長狀況不理想等的問題。因此，亟待改進干細胞體外培養的方法，在保障安全性的同時，使細胞獲得良好的生長狀態，同時還可以降低培養的經濟成本。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種獨特的培養方法，為人間充質干細胞的體外培養提供一種無血清馴化的方法。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。*除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為重量百分數。

本發明提供了一種體外培養的方法，其特征在于，該方法使用新鮮的無血清基礎培養基，按照一定的比例添加并置換體外人間充質干細胞的有血清完全培養液，利用間充質干細胞自身在培養過程中分泌的外泌體和微囊成分作為補充，使間充質干細胞完成無血清培養的馴化，最終實現無血清培養體系。馴化后的間充質干細胞的密度及活率、細胞表面的主要標志物與有血清培養基無明顯差異，檢測培養液及外泌體所分泌的細胞因子的組分和豐度發現，與血管生長相關的bFGF、PDGF、VEGF表達量比未馴化細胞有所上升，表1。收獲的細胞可以用于靜脈輸注，收獲的培養上清、外泌體和微囊成分可以用于美容產品的制備。

表1：無血清馴化培養的人間充質干細胞各項指標