[發(fā)明專(zhuān)利]一種區(qū)分GSH、Cys、NAC熒光探針及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810042664.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108276990A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林偉英;徐高平;唐永和;徐安
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C09K11/06
• 分類(lèi)號(hào): C09K11/06;C07D491/16;G01N21/64
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

本發(fā)明提供了一種反應(yīng)靈敏、檢測(cè)限低、特異性好的能夠區(qū)分GSH、NAC、Cys的可檢測(cè)細(xì)胞谷胱甘肽的熒光探針Co?NA，可用于評(píng)價(jià)和研究細(xì)胞內(nèi)GSH、NAC、Cys的生理功能。本發(fā)明的Co?NA熒光探針是一種簡(jiǎn)單，快速，靈敏的GSH、NAC、Cys區(qū)分試劑；在低濃度下即可特異與GSH、NAC、Cys反應(yīng)，抗多種活性氧、氨基酸及含巰基化合物的干擾；在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種區(qū)分細(xì)胞中GSH、Cys、NAC熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，并且與生物的生命活動(dòng)有著密切的聯(lián)系。半胱氨酸(Cys)、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和谷胱甘肽(GSH)是生物體內(nèi)常見(jiàn)的巰基化合物，在維持生物的正常生理活動(dòng)中起著重要的作用。醫(yī)學(xué)研究表明不正常的生理濃度可能引起很多疾病，比如腎功能衰竭、老年癡呆癥、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病、肌肉損傷、皮膚松弛等，它們?cè)谏矬w內(nèi)含量變化可以作為這些疾病診斷的依據(jù)。因此，在生理?xiàng)l件下高選擇性、高靈敏性地檢測(cè)小分子生物硫醇是非常重要的，當(dāng)前已引起廣泛的關(guān)注及深入研究。

目前已經(jīng)應(yīng)用的技術(shù)包括高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)檢測(cè)、光學(xué)分析和質(zhì)譜鑒定，這些方法僅可以在體外監(jiān)測(cè)半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。熒光分子探針不僅靈敏度高選擇性好，而且能夠在活細(xì)胞中檢測(cè)分析物，所以研究者們開(kāi)始關(guān)注將熒光分子探針的這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于對(duì)體外和活細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽進(jìn)行監(jiān)測(cè)或者細(xì)胞熒光成像。目前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了多種基于化學(xué)反應(yīng)的該類(lèi)熒光探針，例如Michael加成和親核取代反應(yīng)等。在這些方法中，利用邁克爾加成使熒光恢復(fù)是一種特別有效的方法。由于這三種氨基酸都含有巰基(-SH)并且在結(jié)構(gòu)和反應(yīng)活性上相差較小，所以這類(lèi)熒光探針很難將GSH、Cys和NAC區(qū)分開(kāi)，因此研發(fā)能夠區(qū)分細(xì)胞中GSH、Cys、NAC的熒光探針是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有探針對(duì)區(qū)分細(xì)胞中GSH、Cys、NAC區(qū)分度不夠的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種反應(yīng)靈敏、檢測(cè)限低、特異性好的可區(qū)分細(xì)胞中的GSH、Cys、NAC的熒光探針Co-NA，可用于評(píng)價(jià)和研究細(xì)胞內(nèi)GSH、Cys、NAC的生理功能。

本發(fā)明的另一目的是提供一種簡(jiǎn)便地合成上述區(qū)分細(xì)胞中GSH、Cys、NAC的熒光探針Co-NA的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種區(qū)分GSH、Cys和NAC的熒光探針，簡(jiǎn)稱(chēng)為Co-NA，具有如式（I）所示的結(jié)構(gòu)：

式（I）。

一種上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

2,3,3-三甲基吲哚季銨鹽與7-二乙胺基-3-氯-4-醛基香豆素在哌啶存在下于乙醇中加熱反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離提純得熒光探針。

所述2,3,3-三甲基吲哚季銨鹽、7-二乙胺基-3-氯-4-醛基香豆素與哌啶的摩爾比為0.8-1:1-1.2:1。

所述加熱溫度為70-80℃，加熱時(shí)間為8-10h。

所述分離提純步驟優(yōu)選為將溶劑蒸餾除去，然后以二氯甲烷：甲醇=40:1（v/v）為淋洗液，使用柱層析提純。

合成路線如下：

。

一種上述熒光探針用于檢測(cè)溶液或細(xì)胞中GSH、Cys或NAC的應(yīng)用。

本發(fā)明中熒光探針的識(shí)別機(jī)理如下：

GSH、Cys和NAC結(jié)構(gòu)如下所示，均能夠與本發(fā)明所述區(qū)分細(xì)胞中GSH、Cys、NAC的熒光探針Co-NA發(fā)生反應(yīng)：

。