[發明專利]一種復合菌種發酵的四君子散的制備方法

在審

• 申請號: 201810042329.2
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN108143764A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 張新厚;郜來林;張策;張會娟
• 申請（專利權）人: 鄭州六興生物科技有限公司
• 主分類號: A61K36/484
• 分類號: A61K36/484;A61K9/14;A61P1/14;A61P37/04;A61P31/14;A61P31/16
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1.一種復合菌種發酵的四君子散的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1）、取四君子散組方中的黨參60份、白術60份、茯苓60份、甘草30份；水洗后烘干、然后粉碎成粉末，粉末大小為40-80目；得到中藥粉劑，備用；

步驟2）、采用復合菌種固態發酵菌種發酵，采用的復合菌種固態發酵菌種分別為：地衣芽孢桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和黨參內生菌1號；

步驟3）、將地衣芽孢桿菌接種到由5份牛肉膏、10份蛋白胨、5份氯化鈉、20份瓊脂和1000份水組成的培養基中，在使用恒溫搖床在34度環境下培養24小時獲得地衣芽孢桿菌原菌液；將黨參內生菌1號菌種接種到PDA培養基中使用恒溫搖床在34℃環境下培養24小時獲得黨參內生菌1號原菌液；將干酪乳桿菌接種到由15份葡萄糖、10份蛋白胨、10份牛肉膏、5份酵母膏、5份檸檬酸鈉、2份磷酸二氫鉀、5份醋酸鈉、0.2份硫酸鎂、0.2份硫酸錳和1000份水組成的培養基中，使用恒溫搖床在34度環境下培養24小時獲得干酪乳桿菌原菌液；使用與干酪乳桿菌相同的培養基和培養環境及方法分別獲得嗜酸乳桿菌原菌液、雙歧桿菌原菌液；然后分別對地衣芽孢桿菌原菌液、干酪乳桿菌原菌液、嗜酸乳桿菌原菌液、雙歧桿菌原菌液、黨參內生菌1號原菌液進行提純；

步驟4）、將提純后的地衣芽孢桿菌原菌液和黨參內生菌1號原菌液，從斜面接入三角瓶中，振蕩培養24小時；將提純后的干酪乳桿菌原菌液、嗜酸乳桿菌原菌液和雙歧桿菌原菌液，從斜面接入克氏瓶中，溫度控制34℃，培養24小時；

步驟5）、將步驟4）中培養后的地衣芽孢桿菌原菌液、干酪乳桿菌原菌液、嗜酸乳桿菌原菌液、雙歧桿菌原菌液、黨參內生菌1號原菌液混合均勻，各個原菌液的占比為：地衣芽孢桿菌原菌液15~25%、干酪乳桿菌原菌液15~25%、嗜酸乳桿菌原菌液15~25%、雙歧桿菌原菌液15~25%、黨參內生菌1號原菌液15~25%，混合均勻后獲得菌種原液，備用；

步驟6）、培養基的制備；培養基采用紅糖、中藥粉劑和水制成，紅糖1~2%，中藥粉劑55~60%，余量為蒸餾水，得到培養基，備用；

步驟7）、將步驟6）獲得的培養基加熱至34℃時接種，將步驟5）得到的菌種原液接種到培養基中，接種量為4％；采用厭氧發酵，溫度34℃，發酵時間48~72小時，當PH值達到4.0時完成發酵，發酵完成以后曬干即得所述的復合菌種發酵的四君子散。

2.根據權利要求1所述的復合菌種發酵的四君子散的制備方法，其特征在于：所述的黨參內生菌1號的分離方法如下：

取黨參切成1cm長小塊，依次進入75%酒精內1分鐘，1%次氯酸鈉溶液15分鐘，然后再用75%酒精浸泡1分鐘，去除表面菌株之后，再用蒸餾水沖洗5遍；插入含有雙抗WA培養基中，放在恒溫培養箱中28度培養；觀察到有0.5cm的菌絲從黨參切口處長出后，將菌絲轉接到PDA培養基中培養；內生菌菌種純化采用平板分離法；分離后培養細菌，然后將細菌產物按照黨參藥典標準檢測法進行測量，最后找到一株真菌，可以產生高效生物活性黨參生物皂苷似成分，即為所述的黨參內生菌1號。

3.根據權利要求2所述的復合菌種發酵的四君子散的制備方法，其特征在于：所述的雙抗WA培養基的制備方法為：取瓊脂15份，加水定容到1000份，加入效價為200 ,150IU/ml的青霉素和鏈霉素，既得所述的雙抗WA培養基。

4.根據權利要求2所述的復合菌種發酵的四君子散的制備方法，其特征在于：所述的PDA培養基的制備方法為：取馬鈴薯200份，切成塊煮沸30分鐘，用紗布過濾，再加入20份葡萄糖和15份瓊脂，溶化后補足水至1000份，既得所述的PDA培養基。