[發明專利]一種鮟鱇魚骨抗腫瘤十二肽的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201810040906.4
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108359703A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 黃芳芳
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;A23L33/18
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

1.一種鮟鱇魚骨抗腫瘤十二肽的制備方法，它選用鮟鱇魚骨作為原料，其特征在于所述的制備方法包括如下步驟：

a）碎料：用高速組織搗碎機將鮟鱇魚骨進行搗碎處理，制成粉狀和微顆粒狀的鮟鱇魚骨粉；

b）酶解：選用中性蛋白酶對鮟鱇魚骨粉進行酶解，制成鮟鱇魚骨粉酶解液；

c）超濾：將鮟鱇魚骨粉酶解液加入超濾系統，用10KD、5KD、3KD的超濾膜進行超濾，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液，進行冷凍干燥，

d）鮟鱇魚酶解液過G-25洗脫液得到5個峰，經體外抗腫瘤實驗篩選，峰2和峰3具有最高的抗腫瘤活性的，收集峰2和峰3，冷凍干燥，進一步分離純化并用高效液相純度檢測；

e）經過反相高效液相色譜( RT-HPLC)純化及氨基酸序列檢測：峰3用HPLC檢測發現，該分子段只有1個洗脫峰，并進行氨基酸序列檢測，其氨基酸序列為Met-Trp- Ile-Phe-His-Asp-Ser-Asp- Lys-Asn- Cys- Arg；制成鮟鱇魚骨抗腫瘤十二肽產品。

2.根據權利要求1所述的鮟鱇魚骨抗腫瘤十二肽的制備方法，其特征在于：

所述的步驟b）酶解條件為：pH:7.0-7.5，溫度：40-45℃，料液比：1:1，時間：5-7h, 加酶量:1200-1500 u/g；

所述的步驟d）中，所述G-25凝膠分離是：將步驟c）獲得的酶解液用蒸餾水進行溶解，離心，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，取酶解液溶液1.5ml過Sephadex G-25柱(90cm×115cm(ID))，用蒸餾水為洗脫液，平衡和洗脫；每管收集3ml，于λ280 nm 處檢測，收集各峰洗脫液；

所述的步驟e）中，所述反相高效液相色譜( RT- HPLC)是：即用RT-HPLC進行純化，色譜條件: 1)樣品前處理:將樣品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，離心（12000-14000 RPM，離心10分鐘）取上清；2)系統: Agilent 1260 HPLC；3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um；4)進樣體積:80-100ul；5)緩沖液、平衡緩沖液: 0.06%TFA洗脫緩沖液: 0.05%TFA的乙腈；6) 梯度:0%–0 % B洗脫4分鐘，0%–8% B洗脫25分鐘，8%-100%B洗脫1分鐘，100% -100%B洗脫5分鐘；7)流速:1.0 ml/min；8）檢測:280nm/214nm。

3.一種如權利要求1或2所述鮟鱇魚骨抗腫瘤十二肽的應用，其特征在于所述的鮟鱇魚骨抗腫瘤十二肽作為功能食品，用于前列腺癌患者的輔助功能性食品，對前列腺癌的抑制作用明顯。