[發(fā)明專利]一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFRG719X基因變異的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810039485.3
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN107937496A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王昕昀
• 申請（專利權(quán)）人: 良培基因生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

1.ddPCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的引物和探針，其特征在于，EGFR G719X基因變異包括EGFR G719A基因變異、EGFR G719S基因變異和EGFR G719C基因變異，用于檢測EGFR G719X基因變異的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于檢測EGFR G719X基因變異的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因變異的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因變異的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因變異的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，EGFR G719X野生型的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ddPCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的引物和探針，其特征在于，所述EGFR G719A基因變異的檢測探針、EGFR G719S基因變異的檢測探針、EGFR G719C基因變異的檢測探針、EGFR G719X野生型的檢測探針均為經(jīng)過熒光標記的，其5’端標記有報告基團，3’端標記有非熒光淬滅基團。

3.一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，包含以下步驟：

1)提取受試者骨髓、外周血或組織的cfDNA；

2)以cfDNA為模板，將待測樣品cfDNA模板、用于檢測EGFR G719X基因變異的上下游引物、EGFR G719X基因變異的檢測探針、EGFR G719X野生型的檢測探針以及PCR預(yù)混液混合，制備ddPCR混合液；

所述EGFR G719X基因變異包括EGFR G719A基因變異、EGFR G719S基因變異和EGFR G719C基因變異，用于檢測EGFR G719X基因變異的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于檢測EGFR G719X基因變異的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因變異的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因變異的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因變異的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，，EGFR G719X野生型的檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

3)ddPCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴，再進行PCR擴增反應(yīng)；

4)信號收集并進行結(jié)果判讀：PCR擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物進行信號收集，根據(jù)熒光信號類型判斷待測樣品中是否含有EGFR G719X基因變異的模板和發(fā)生突變的模板數(shù)量及含量。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量為0.3～2ng/μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量為1ng/μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均為400～700nM，EGFR G719X基因變異的檢測探針、EGFR G719X野生型的檢測探針含量均為200～400nM。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均為500nM，EGFR G719X基因變異的檢測探針、EGFR G719X野生型的檢測探針含量均為250nM。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，步驟4)中ddPCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴的方法為：將ddPCR混合液加入微滴發(fā)生器，生成10000-20000個微反應(yīng)液滴。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，步驟3)中PCR擴增反應(yīng)條件為：93-97℃預(yù)變性3-15分鐘；93-95℃變性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共進行35-45個循環(huán)，2-10℃終止反應(yīng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR G719X基因變異的方法，其特征在于，步驟3)中PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火/延伸1分鐘，共進行40個循環(huán)，10℃終止反應(yīng)。