[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于溶酶體內(nèi)HOCl檢測的熒光探針的制備及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810037797.0
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN110041350B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 申世立;曹曉群;葛燕青
• 申請（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
• 主分類號: C07D519/00
• 分類號: C07D519/00;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發(fā)明公開了一種能應(yīng)用于溶酶體HOCl檢測的熒光探針。所述探針以咪唑并[1,5?a]吡啶作為能量供體，羅丹明作為能量受體，硫代雙酰肼結(jié)構(gòu)作為次氯酸的響應(yīng)基團，嗎啉結(jié)構(gòu)為溶酶體定位基團。在HOCl存在條件下，羅丹明基團轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)結(jié)構(gòu)，探針同時發(fā)射出463 nm和588 nm的熒光，隨著次氯酸濃度的增加，588 nm處的熒光逐漸增強，而463 nm處的熒光強度降低，二者的比值（I₅₈₈/I₄₆₃）與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)（0?3μM）呈良好的線性關(guān)系。本發(fā)明的探針具有很強的溶酶體靶向能力，能夠高選擇性、高靈敏地檢測溶酶體內(nèi)次氯酸，具有巨大的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種HOCl熒光探針的合成及在溶酶體內(nèi)HOCl檢測方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

生物體內(nèi)HOCl是過氧化氫與氯離子在髓過氧化物酶的催化下產(chǎn)生的，其在許多生理活動中起著重要的作用。例如，HOCl可以殺滅入侵到生物體的細菌，是生物體自身的天然殺菌劑。但同時，HOCl也是一把“雙刃劍”，生物體內(nèi)過量產(chǎn)生的HOCl會導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化甚至癌癥等疾病。因此，實時監(jiān)測細胞內(nèi)次氯酸濃度具有重要的生物學(xué)意義。

由于熒光探針具有高靈敏性和選擇性、響應(yīng)快、操作簡單、對細胞無損傷等優(yōu)點，利用熒光探針檢測細胞內(nèi)HOCl的方法得到了快速發(fā)展。

然而，大多數(shù)HOCl探針是利用單熒光強度高低來測定被檢測物濃度，其檢測結(jié)果易受到環(huán)境因素的影響，而造成誤差；而比率型熒光探針能夠較好地消除外界環(huán)境的干擾，因此比率型HOCl熒光探針受到越來越多的關(guān)注。

現(xiàn)有文獻報道的HOCl熒光探針很少具有細胞器靶向功能，因此并不能實現(xiàn)細胞器內(nèi)HOCl檢測。而溶酶體靶向的次氯酸熒光探針報道則更少。

基于HOCl熒光探針存在的不足之處，發(fā)明人設(shè)計合成了一種比率型HOCl熒光探針，并在結(jié)構(gòu)中引入溶酶體靶向基團，實現(xiàn)探針分子在細胞內(nèi)靶向溶酶體作用，并成功應(yīng)用于溶酶體內(nèi)HOCl的檢測，為溶酶體HOCl異常相關(guān)研究提供了新的工具。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種能夠應(yīng)用于HOCl檢測的熒光探針，具有如下結(jié)構(gòu)（RIL）：

本發(fā)明所述次氯酸的熒光探針的制備方法，如圖1所示：

本發(fā)明的所述熒光探針能夠用于檢測溶液中HOCl。

在HOCl存在條件下，探針分子的硫代雙酰肼結(jié)構(gòu)氧化成1,3,4-噁二唑結(jié)構(gòu)，羅丹明基團轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)結(jié)構(gòu)，探針同時發(fā)射出463 nm和588 nm的熒光，隨著次氯酸濃度的增加，588 nm處的熒光逐漸增強，而463 nm處的熒光強度降低，二者的比值（I₅₈₈/I₄₆₃）與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)（0-3 μM）呈良好的線性關(guān)系，如圖2所示。

本發(fā)明所述的熒光探針還能夠應(yīng)用于細胞溶酶體內(nèi)HOCl檢測。

配制本發(fā)明所述次氯酸探針的PBS（0.01 M）緩沖溶液與乙醇（V/V = 7:3，pH6.00）的溶液。分別加入一定量金屬離子、活性氧和活性氮物種，然后對上述樣品進行熒光測試，結(jié)果表明探針對次氯酸有良好的選擇性，如圖3所示。

用LPS處理RAW264.7細胞后，再分別用本發(fā)明所述探針和商品化的溶酶體染料Lyso Tracker Deep Red繼續(xù)孵育，然后進行共聚焦成像分析，結(jié)果表明本發(fā)明探針可以很好地富集于溶酶體內(nèi)，如圖4所示。

用本發(fā)明探針孵育RAW264.7細胞，然后用LPS處理細胞，然后進行共聚焦成像分析，探針藍色熒光強度降低，而紅色熒光強度明顯增強，紅色/藍色熒光強度比值增大，因此上述探針可以用于內(nèi)源性次氯酸的檢測，如圖5所示。