[發明專利]一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 201810035935.1
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108179174A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 李澤卿
• 申請（專利權）人: 武漢愛基百客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：選擇不同類型的基因組DNA樣本，并將基因組DNA樣本在10-20攝氏度的無菌環境中進行保存，并用限制性內切酶分別對不同的基因組DNA樣本進行酶切，且在酶切時，需將不同樣本分時段進行酶切，從而能避免不同樣本發生接觸，影響基因組DNA樣本的原始形態；

S2：完成酶切后，能夠獲得多組不同類型基因組DNA樣本的DNA片段，并將不同的DNA片段分別進行儲存，且儲存環境為2-8攝氏度，并向DNA片段內添加lamda噬菌體基因組DNA，能夠將DNA片段末端進行修復，然后再次向其中添加堿基，并將其儲存12-24h，然后備用；

S3：將S2中儲存后的不同類型的DNA片段取出，并在放置在15-25攝氏度的反應器皿內，并將不同的DNA片段分別與含有不同條形碼序列的甲基化接頭相連接，從而獲取不同類型的連接產物，然后將連接產物置于純化儀器內，并在5-15攝氏度的條件下利用水解酶對連接產物進行純化20-40min；

S4：將S3中純化后的連接產物添加擴增引物，進行PCR擴增，獲得含有不同條形碼序列的擴增產物，然后確定每組擴增產物的量，進行瓊脂糖凝膠分離后，再次進行純化，獲得特定長度的擴增片段；

S5：將S4中擴增后的擴增片段再次置于瓊脂糖凝膠中，然后經瓊脂糖凝膠電泳后回收DNA片段作為測序文庫，采用芯片分析系統進行最終的質量檢測和測序。

2.根據權利要求1所述的一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法，其特征在于：所述的甲基化接頭包括正鏈和負鏈，具體為：

正鏈：3’ACACTCTTTCTCTACACGAGGCTCTTCGGATAT5’，

負鏈：3’ACATCCGGAGAGCGGTCCAGCAGGAATGCCGAG5’。

3.根據權利要求1所述的一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法，其特征在于：所述的甲基化接頭包括正鏈和負鏈，具體為：

正鏈：3’AGACTCTGTCTCTACACGAGGCTCTATGGATAT5’，

負鏈：3’AGATACGAAGAGCGGTCCAGCAGGAATGGCGAG5’。

4.根據權利要求1所述的一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法，其特征在于：在S5中的測序文庫為經瓊脂糖凝膠電泳回收得到的200-300bp的DNA片段。

5.根據權利要求1所述的一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法，其特征在于：在上述中，需實時檢測DNA片段的酸堿度，從而確定DNA片段的pH范圍。

6.根據權利要求1所述的一種高通量簡化基因組測序文庫的構建方法，其特征在于：在S4中的擴增引物序列為：

引物序列P1：CAACCAGGAGATGGCATATG,

引物序列P2：AATGATATGCCGACGATCGA。