[發明專利]一種用于鑒定蘇州青的分子鑒別方法和引物

有效

• 申請號: 201810035662.0
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN107988416B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 張艷梅;孫小芹;杭悅宇;陳閩
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

本發明公開了一種用于鑒定蘇州青的分子鑒別方法和引物。一條通能夠在蘇州青中擴增到的特異性DNA片段，該片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。根據此特異性片段的核苷酸序列，設計序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的一對引物，能夠在蘇州青中擴增出特定長度的片段，而在其他青菜品種中則不能擴增出該片段，從而實現對蘇州青的特異性鑒別。本發明操作簡便、穩定可靠，是第一個應用于蘇州青品種的分子鑒定方法，可用于該品種的選種、育種、種植、采收和品種貿易等各環節中的快速鑒定，同時對保護蘇州市優良地方品種的種質資源具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于分子標記鑒定領域，特別涉及一種用于鑒定蘇州青的分子鑒別方法和引物。

背景技術

青菜(Brassica rapa var.chinensis(L.)Kitam.)又名不結球白菜，為十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica L.)植物，一年生或二年生草本，是我國常見的綠葉蔬菜之一。長江以南為青菜的主要產區，四季生產，市場需求量大。青菜原產中國，栽培歷史悠久，品種繁多。目前對青菜種質資源的鑒別主要依據株型、莖、葉、種皮等形態學特征，但由于大部分青菜品種在苗期形態相似，直到成株才開始表現出品種的特性，且形態學的特征常常存在過渡和交叉，難以劃定明確的界限，給青菜的品種鑒定造成了極大的困難。

蘇州青是蘇州市優良地方品種和主栽青菜品種，屬于不結球白菜中的青梗菜類型，具有生長期短、適應性強、產量高、品質好、營養豐富等特點。其粗纖維的含量在國產品種中為最低，糖和葉綠素含量高，糯性品質好，質地鮮嫩，長江中下游地區的江蘇、安徽、浙江、上海等地均有大面積栽培。80年代以后，經過不斷的推廣，已在我國普遍種植，并有部分種子出口到日本、東南亞等國，受到一致好評。蘇州青青菜株型直立、較矮；葉片深綠色，橢圓形或近圓形，葉面平滑，全緣，葉脈明顯凸出；葉柄短，綠色，基部肥厚。它在形態上與一些青菜品種十分相近，如與上海青僅在株高、葉柄長及葉色存在細微差別，因而易于同其他品種相混淆。因此，開發蘇州青保護性、專一性鑒別分子標記具有重要的科學意義和應用價值。

近年來，隨著DNA分子標記技術的逐漸成熟，在農作物的品種鑒定上也得到了廣泛應用。DNA分子標記相對于傳統的遺傳標記具有遺傳多態性高、變異豐富；穩定性高，不受取材部位、發育階段和環境因素影響；檢測手段便捷、準確率高等多項優勢。目前常用的DNA分子標記主要有RFLP、RAPD、AFLP、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中SCAR(Sequencecharacterized amplified region)即序列特異性擴增區域，由Paran和Michelmore于1993年提出，是一種采用特定引物的基于PCR擴增的分子標記技術。通常是由RAPD、SRAP、ISSR標記轉化而來，是將上述分子標記篩選出的特異標記片段進行克隆和測序，根據其堿基序列設計一對特異引物，用于對特征區域的特異性擴增。SCAR標記一般表現為擴增片段的有或無，是一種顯性標記，具有特異性高、穩定性好、可重復性強等優點，且技術簡單、檢測迅速、樣品用量少、實驗成本低，因而成為育種實踐中應用的首選標記。

目前對于青菜品種的分子鑒定研究大多利用RAPD、AFLP、SSR等方法，但這些方法操作繁瑣、重復性差，并且不是可直接應用的專一性、特異性分子標記，因此不適合用于穩定、快速、準確的品種鑒別體系的開發。本發明是首次對蘇州地方名特優品種——蘇州青進行分子標記的研究，本發明提供的鑒定蘇州青的ISSR-SCAR標記方法具有操作簡單、靈敏度高、重復性好等優點，無需酶切、克隆、探針制備、分子雜交等工作，能夠迅速、高效地實現對蘇州青的特異性鑒定，對于保護地理標志產品的種質資源具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒定蘇州著名青菜農家品種——蘇州青的特異性分子標記方法，通過篩選到的ISSR引物在蘇州青中擴增出特異性條帶，并針對該特異性條帶設計SCAR引物，利用這對引物可通過簡單的DNA片段擴增技術將蘇州青和其它青菜品種區分開來，實現對蘇州青的快速、準確鑒定。該發明為青菜的品種鑒別和種質資源保護提供了有力的技術支持。