[發明專利]一種基因組簡化與二代測序SNP復合檢測體系和檢測方法

在審

• 申請號: 201810035165.0
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108148899A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 李澤卿
• 申請（專利權）人: 武漢愛基百客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明公開了一種基因組簡化與二代測序SNP復合檢測體系和檢測方法，包括如下步驟：將形成的擴增產物內添加底物，從而能夠合成第一個堿基，并清除所有游離的堿基，在測序時，選取PTP平板，且PTP平板表面含有160萬個光纖孔，光纖孔內載有化學發光反應所需的各種酶以及底物，然后將堿基依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP平板，假如發生堿基配對，會釋放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化熒光素，同時釋放光信號，實時利用高靈敏度CCD捕獲，堿基和PTP平板進行配對，然后捕獲到一分子的光信號，由此一一對應，能夠準確、快速的確定待測模板的堿基序列。本發明能夠對基因組進行準確的測序。

技術領域

本發明涉及基因組測序技術領域，尤其涉及一種基因組簡化與二代測序SNP復合檢測體系和檢測方法。

背景技術

DNA測序作為一種重要的實驗技術，在生物學研究中有著廣泛的應用。早在DNA雙螺旋結構(Watson and Crick,1953)被發現后不久就有人報道過DNA測序技術，但是當時的操作流程復雜，沒能形成規模。Sanger法因為既簡便又快速，并經過后續的不斷改良，成為了迄今為止DNA測序的主流。然而隨著科學的發展，傳統的Sanger測序已經不能完全滿足研究的需要，對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序，都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術，第二代測序技術(Next-generation sequencing)應運而生。這三個技術平臺各有優點，454FLX的測序片段比較長，高質量的讀長(read)能達到400bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準確度高，原始堿基數據的準確度大于99.94％，而在15X覆蓋率時的準確度可以達到99.999％，是目前第二代測序技術中準確度最高的。為此，我們提出了一種基因組簡化與二代測序SNP復合檢測體系和檢測方法。

發明內容

本發明提出了一種基因組簡化與二代測序SNP復合檢測體系和檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

本發明提出了一種基因組簡化與二代測序SNP復合檢測體系和檢測方法，包括如下步驟：

S1：選取目標DNA，并利用內切酶對目標DNA進行酶切，以便獲得目標DNA片段，完成后，將其置于零下10-零下2攝氏度的無菌儲存箱內，備用；

S2：再次選取DNA模板，并在DNA模板表面涂抹DNA模板制備液，且DNA模板制備液需均勻涂抹，以保證反應的準確度；

S3：向S1中處理的目標DNA片段內添加DNA修復酶，并在15-25攝氏度的環境下，能夠將目標DNA片段末端進行修復，然后再次向其中添加堿基，并將其儲存3-6h，然后備用；

S4：將S3中儲存后的目標DNA片段取出，并在放置在15-25攝氏度的反應器皿內，并將目標DNA片段分別與甲基化引物相連接，從而獲取的連接產物；

S5：將S4中產生的連接產物置于S2中的DNA模板內，并將目標DNA片段結合到擴增引物表面，然后將目標DNA片段進行擴增，從而能夠形成擴增產物；

S6：將形成的擴增產物內添加底物，從而能夠合成第一個堿基，并清除所有游離的堿基，在測序時，選取PTP平板，且PTP平板表面含有160萬個光纖孔，光纖孔內載有化學發光反應所需的各種酶以及底物，然后將堿基依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP平板，假如發生堿基配對，會釋放焦磷酸，焦磷酸在酶的作用下，形成氧化熒光素，同時釋放光信號，以獲取信號；

S7：將S6中釋放的光信號，實時利用高靈敏度CCD捕獲，堿基和PTP平板進行配對，然后捕獲到一分子的光信號，由此一一對應，能夠準確、快速的確定待測模板的堿基序列。

本發明還提出了一種DNA模板的制備方法，具體步驟如下：