[發(fā)明專(zhuān)利]含CpG-ODN基序重組抑制素質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810034378.1
• 申請(qǐng)日: 2018-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108148860B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王水蓮;陽(yáng)美霞;李躍偉;張虹亮;張羽芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 長(zhǎng)沙正奇專(zhuān)利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

一種含CpG?ODN基序重組抑制素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，是選擇對(duì)小鼠細(xì)胞具有激活作用的CpG基序5'?GACGTT?3'，設(shè)計(jì)具有免疫作用的如SEQ ID No.1所示的CpG?ODN片段；再將CpG?ODN片段和pEGISI質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、純化后，得重組抑制素質(zhì)粒pEGISI?CpG?ODN。該重組抑制素質(zhì)粒pEGISI?CpG?ODN轉(zhuǎn)染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞后能極顯著降低促凋亡基因Fas、FasL、DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3 mRNA的表達(dá)水平，表明CpG?ODN基序可拮抗抑制素的作用，下調(diào)促凋亡基因的表達(dá)量，影響卵泡發(fā)育。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物基因工程，具體涉及一種含CpG-ODN基序重組抑制素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，同時(shí)涉及該重組抑制素質(zhì)粒對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞相關(guān)凋亡基因表達(dá)的影響。

背景技術(shù)

哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育是由體內(nèi)各種生長(zhǎng)因子、垂體促性腺激素和類(lèi)固醇激素共同調(diào)節(jié)的一個(gè)連續(xù)而復(fù)雜的生理過(guò)程。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞分泌的抑制素(Inhibin,INH)是由α和β亞基組成的異二聚體糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growthfactor beta，TGFβ)超家族成員之一，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式調(diào)控類(lèi)固醇激素產(chǎn)生及卵母細(xì)胞成熟，參與卵泡發(fā)育，甚至在豬的卵泡發(fā)育過(guò)程中上調(diào)卵泡閉鎖率。

CpG寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)是含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤基序的短單鏈合成DNA分子。研究表明，CpG-ODN具有免疫刺激活性，能誘導(dǎo)Ⅰ型免疫應(yīng)答，隨后激活機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫。激活人體細(xì)胞的最佳CpG-ODN基序是5'-GTCGTT-3'，而對(duì)小鼠細(xì)胞具有活化作用的最佳CpG-ODN基序是5'-GACGTT-3'。用合成的CpG-ODN能有效激活人和小鼠TLR9介導(dǎo)的NF-κB激活和細(xì)胞因子，并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)激。含CpG-ODN的疫苗可介導(dǎo)細(xì)胞增殖，干擾啟動(dòng)子活性和免疫基因的表達(dá)，顯著增加動(dòng)物體內(nèi)IgM和抗病毒分子Mx2的含量。盡管CpG-ODN作為佐劑已表現(xiàn)出提高動(dòng)物免疫力的能力，但是否影響哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育尤其是顆粒細(xì)胞發(fā)育尚無(wú)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含CpG-ODN基序重組抑制素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，同時(shí)提供該重組抑制素質(zhì)粒對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞相關(guān)凋亡基因表達(dá)的影響。

本發(fā)明選擇對(duì)小鼠細(xì)胞具有免疫刺激活性的CpG-ODN基序，構(gòu)建含基序CpG-ODN片段和抑制素α(1～32)片段的重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN，并轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中死亡受體通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化，以探討CpG-ODN是否抑制小鼠顆粒細(xì)胞發(fā)育，為臨床上開(kāi)發(fā)促進(jìn)哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育和提高動(dòng)物繁殖力的新型基因疫苗提供新思路。

具體地，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種含CpG-ODN基序重組抑制素質(zhì)粒的構(gòu)建方法，該方法步驟如下：

a.選擇對(duì)小鼠細(xì)胞具有激活作用的CpG基序5'-GACGTT-3'，設(shè)計(jì)具有免疫作用的如SEQ ID No.1所示的CpG-ODN片段；

b.將CpG-ODN片段和pEGISI質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、純化后，得重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN。

本發(fā)明同時(shí)提供上述方法構(gòu)建得到的重組抑制素質(zhì)粒pEGISI-CpG-ODN在下調(diào)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞促凋亡基因Fas、FasL、DR4/5、TRAIL、Caspase8和Caspase3mRNA的表達(dá)水平中的應(yīng)用，從而抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。