[發(fā)明專利]一種催化活性提高的菜豆環(huán)氧化物水解酶突變體及其應用

有效

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• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108048423B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設計）人: 鄔敏辰;闞婷婷;蘇永君;王婷婷;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12P41/00;C12P17/02
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種催化活性提高的菜豆環(huán)氧化物水解酶突變體及其應用，屬于基因工程和蛋白質表達領域。本發(fā)明的突變體是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基礎上，將第196位的亮氨酸突變成了天冬氨酸。本發(fā)明搖瓶誘導10h得到的突變酶PvEH1^L196D催化活性為69.92U/g，是野生型酶(49.53U/g)的1.41倍。

技術領域

本發(fā)明涉及一種催化活性提高的菜豆環(huán)氧化物水解酶突變體及其應用，屬于基因工程和蛋白質表達領域。

背景技術

手性環(huán)氧化物和鄰二醇是合成手性藥物、農(nóng)業(yè)、香料及精細化工等行業(yè)各種活性物質的中藥中間體，具有廣闊的應用前景和市場需要求。光活性的手性化合物具有不同于外消旋體的獨特性質，其在生物體內(nèi)的代謝途徑、代謝速率、藥理以及毒性等方面的差異，時期在化學和生命科學產(chǎn)業(yè)有著嶄新和特殊的用途。20世紀60年代，震驚世界的“反應停事件”已經(jīng)充分說明獲得光學純化合物的必要性。傳統(tǒng)的化學拆分環(huán)氧化物往往需要重金屬類毒物質作為催化劑，不僅面臨著環(huán)境的巨大挑戰(zhàn)，且很難獲得高產(chǎn)率的手性純化合物。

環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能夠催化外消旋環(huán)氧化物的水解動力學拆分或對映歸一性水解，保留單一構型環(huán)氧化物或轉化為手性鄰二醇。是一種典型的α/β折疊型水解酶。EHs具有反應時不需要金屬離子和輔酶、來源廣泛、對映選擇性高等優(yōu)點，成為一種非常有潛力的生物催化劑，具有較高的研究價值。然而，不同來源的EHs的性質均存在著很大的差異，自然界篩選到的EHs往往存在酶活低、立體選擇性低一級穩(wěn)定性差等缺陷，萬萬不能滿足工業(yè)化應用的要求。另外，底物為水不溶性有機化合物易自發(fā)水解，且不利于酶的催化反應，存在底物/產(chǎn)物抑制作用的等不利因素，限制了他們在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛和有效的應用。如何不斷將EHs改造和篩選出比酶活高、立體選擇性強、極端環(huán)境耐受性好的優(yōu)良酶，并且有效的應用于工業(yè)生產(chǎn)中，已稱為現(xiàn)在面臨的最大挑戰(zhàn)。

從菜豆(Phaseolus vulgaris)克隆了一種環(huán)氧化物水解酶(PvEH1)，并實現(xiàn)其在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中異源表達。通過同源建模分析該酶的蛋白質結構，并通過定點突變技術對PvEH1進行分子改造，提高其酶活，具有較強的工業(yè)化應用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的第一個問題是提供一種催化活性提高的環(huán)氧化物水解酶(PvEH1)突變體。

所述突變體是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白質；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的氨基酸序列雜交且編碼具有環(huán)氧化物水解酶活性的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述突變體的基因的核苷酸序列是SEQ IDNO.3所示的序列。

本發(fā)明還提供獲得所述突變體的方法，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基礎上，將第196位的亮氨酸突變成了天冬氨酸(L196D)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，以攜帶編碼環(huán)氧化物水解酶的基因pveh1的重組質粒為模板，設計并合成引物，通過PCR進行定點突變，得到攜帶編碼突變體的基因的重組質粒，轉化表達宿主；培養(yǎng)宿主使之產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶突變體。

本發(fā)明還提供一種表達所述環(huán)氧化物水解酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌的構建方法包括以下步驟：以攜帶編碼環(huán)氧化物水解酶的基因pveh1的重組質粒為模板，設計并合成引物，通過PCR進行定點突變，得到攜帶編碼突變體的基因的重組質粒，轉化表達宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述攜帶編碼環(huán)氧化物水解酶的基因pveh1的重組質粒為pET28a(+)-pveh1，表達宿主為E.coli BL21(DE3)。