[發(fā)明專利]鼻腔盥洗液外泌體的制備、鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810033509.4
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108225875A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳靜;張薇;尤易文;游波;單穎;施思;包麗麗;樂慧君;張潔
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N33/48
• 代理公司: 南通市永通專利事務(wù)所(普通合伙) 32100
• 代理人: 葛雷

1.一種非診斷用途的鼻腔盥洗液外泌體的制備、鑒定方法，其特征是：包括下列步驟：

（一）鼻腔盥洗液的采集

分別采集健康志愿者和慢性鼻竇炎患者鼻腔盥洗液；具體操作過程如下：將5毫升生理鹽水滴注在受試者的左鼻孔，囑頭部呈30°向后傾斜，軟腭關(guān)閉，然后頭部向前傾斜，收集鼻腔盥洗液；右鼻孔重復(fù)上述步驟；

（二）外泌體的提取與純化

①將收集的鼻腔盥洗液通過濾網(wǎng)抽濾，初步過濾雜質(zhì)及細菌；

②將抽濾后的鼻腔盥洗液在4℃、3000g的離心條件下離心10分鐘，分離去除鼻腔盥洗液中的細胞及其他雜質(zhì)，然后得到上層液體；

③將步驟②得到的上層液體移入第二離心管中，在4℃、6000g的離心條件下離心30分鐘，進一步分離去除雜質(zhì)，得到上層液體；

④將步驟③得到的上層液體移入第三離心管中，在4℃、10000g的離心條件下離心1小時，得到上層液體；

⑤將步驟④得到的上層液體移入超離管中，在4℃、10,0000g的離心條件下離心1小時，移除上層液體后，得到沉淀；

⑥將步驟⑤得到的沉淀用PBS重懸洗滌后，通過分子排阻色譜法進一步純化；

⑦將步驟⑥處理后的鼻腔盥洗液移入超離管，在4℃、10,0000g的離心條件下再次離心1小時，得到沉淀于該離心管底部的鼻腔盥洗液的總外泌體；

（三）電鏡鑒定外泌體

①將上述所得到的外泌體用PBS溶液重懸；

②滴加20mL/L、pH6.8磷鎢酸溶液，1:1混勻；

③液取上述混勻液體 5ul滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫下負染10分鐘，白織燈下烤干；

④透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)：所得產(chǎn)物為50-100nm大小的雙分子層膜結(jié)構(gòu)泡體；

（四）免疫印跡檢測蛋白CD9、CD63的存在

①將提取純化得到的外泌體用1ml的1×PBS重懸，得到外泌體重懸液，加入1ml裂解液，提取總蛋白；

②BCA法測定外泌體蛋白含量；

③制作10％及4％的梯度膠，加入足夠的緩沖液，每孔上樣50ug的外泌體總蛋白；

④安裝電極，接上電源，恒壓80V，使蛋白質(zhì)跑到同一條起跑線上，蛋白質(zhì)跑至分離膠上時改為120V；

⑤切膠，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液；將PVDF膜放置在甲醇中極化，蒸餾水中水化后放入轉(zhuǎn)膜液，與棉墊及濾紙一起在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min；

⑥將PVDF膜、膠、棉墊及濾紙制作成“三明治”結(jié)構(gòu)，第一層為棉墊，第二層為濾紙，第三層為膠，第四層為PVDF膜，第五層為濾紙，第六層為棉墊，夾緊；放入轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，加入轉(zhuǎn)膜液和冰盒，轉(zhuǎn)膜槽放在裝滿冰水的盆里；安裝電極、接好電源，轉(zhuǎn)膜條件設(shè)定為恒流200 mA，時間90 min；

⑦轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，進行標記，放在搖床上，TBST洗5 min × 3次，5 %脫脂牛奶封閉1-2h；TBST洗膜5 min×3次；加一抗CD9、CD63孵育，室溫1 h后4℃過夜；

⑧TBST洗膜10 min × 3次；二抗孵育，室溫2 h；TBST洗20 min × 3次；

⑨暗室內(nèi)顯影，沖洗X感光膠片；

經(jīng)上述方法所得產(chǎn)物中檢測到了外泌體表面特有的蛋白CD9、CD63的表達。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷用途的鼻腔盥洗液外泌體的制備、鑒定方法，其特征是：采用納米顆粒示蹤技術(shù)進一步鑒定外泌體，分析檢測了提取純化得到的外泌體的濃度、大小，與外泌體的表征相符。