[發(fā)明專利]一種制備禽類睪丸間質細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810031382.2
• 申請日: 2018-01-12
• 公開（公告）號: CN108192858A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 齊曉龍;郭勇;陳余;尚明玉;陳晨;盛熙暉
• 申請（專利權）人: 北京農(nóng)學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京匯知杰知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11587
• 代理人: 楊巍;蔡倫

本發(fā)明屬于細胞分離純化領域；更具體地，本發(fā)明涉及一種制備禽類睪丸間質細胞的方法，所述方法包括以下步驟：用膠原酶消化睪丸組織塊以獲得細胞懸液；通過差速離心法離心步驟a)獲得的細胞懸液，由此分離獲得睪丸間質細胞；通過差速貼壁法培養(yǎng)步驟b)獲得的睪丸間質細胞，由此富集睪丸間質細胞。本發(fā)明的制備禽類睪丸間質細胞的方法可以獲得細胞量大且純度高的睪丸間質細胞，操作過程簡單規(guī)范，對細胞損傷較小，且有效地減少了細胞污染。

技術領域

本發(fā)明屬于細胞分離純化領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種制備禽類睪丸間質細胞的方法。

背景技術

睪丸間質細胞(Leydig cell,LC)分布于睪丸曲細精管間隙中，是合成和分泌雄激素的主要場所。睪丸間質細胞分泌的睪酮占動物體內睪酮總量的96％左右。由于睪酮與靶器官受體結合后可發(fā)揮諸多重要的生理功能，所以睪丸間質細胞作為分泌睪酮最主要的細胞，其分離培養(yǎng)技術越來越受到人們的重視。因此，建立一套穩(wěn)定高效便捷的睪丸間質細胞的原代細胞分離、培養(yǎng)和純化的方法，對深入研究睪丸間質細胞相關功能具有重要意義。

睪丸間質細胞的分離培養(yǎng)研究在哺乳動物諸如豬、羊等以及嚙齒類動物大鼠、小鼠中較為常見，技術相對比較成熟，而在禽類的研究較少。目前禽類睪丸間質細胞分離方法基本與嚙齒類動物相似，均采用Percoll連續(xù)密度梯度離心法分離收集睪丸間質細胞。本發(fā)明人前期也采用Percoll法在種公雞中做了類似的預試驗，結果表明，種公雞的睪丸間質細胞主要集中在30～60％Percoll層中，但單只種公雞的一對睪丸所獲得的細胞在Percoll層中的量很少，且活率、純度很低。

綜上，本領域亟需一種簡單快速的制備禽類睪丸間質細胞的方法，該方法所獲得的禽類睪丸間質細胞，不僅數(shù)量大，而且純度高。建立這樣的方法，可解決構建保持雄激素分泌活性的細胞模型，為研究種用家禽生殖生理的分子機制及睪丸間質細胞相關功能提供良好的試驗平臺。

發(fā)明內容

如上所述，在本領域中，對于哺乳動物睪丸間質細胞，已經(jīng)開發(fā)出了成熟的分離和純化技術，然而對于禽類睪丸間質細胞的分離和純化，當前的方法所分離出來的睪丸間質細胞純度不夠高，并且也相對比較繁瑣，不夠簡便、快捷。

為解決上述問題，本發(fā)明人經(jīng)過反復研究，開發(fā)出了一種制備禽類睪丸間質細胞的方法，該方法不僅簡便、快捷，而且所獲得的睪丸間質細胞數(shù)量多、純度高。

因此，本發(fā)明提供了一種制備睪丸間質細胞的方法，包括以下步驟：

a)用膠原酶消化睪丸組織塊以獲得細胞懸液；

b)通過差速離心法離心步驟a)獲得的細胞懸液，由此分離獲得睪丸間質細胞；

c)通過差速貼壁法培養(yǎng)步驟b)獲得的睪丸間質細胞，由此富集睪丸間質細胞。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的家禽睪丸間質細胞分離培養(yǎng)方法相比，具有以下有益效果：目前，對睪丸生殖細胞的分離培養(yǎng)多以Percoll連續(xù)密度梯度離心法和胰蛋白酶消化法或二者結合為主，有文獻報道采用Percoll梯度分離液分離家禽睪丸間質細胞，經(jīng)離心后可得到較純的睪丸間質細胞，但獲得的細胞總量較少。本發(fā)明前期也做了類似的預試驗，但結果表明，Pecoll梯度離心法費時費力，經(jīng)長時間離心會導致大量細胞死亡。且家禽的睪丸間質細胞在Percoll層中數(shù)量極少，細胞純度較低，單只公雞獲得的一對睪丸經(jīng)分離培養(yǎng)獲得的原代睪丸間質細胞無法滿足試驗需要，耗費試驗材料。然而，通過采用本發(fā)明方法，可以使細胞活率達到96.08％，純度達到97.73％。因此，本發(fā)明的方法為深入研究禽類睪丸間質細胞的相關功能提供良好的細胞工作平臺。

附圖說明

圖1示出原代睪丸間質細胞的照片(100×)；

圖2示出第三代睪丸間質細胞的照片(100×)；

圖3示出3β-HSD染色后的第三代睪丸間質細胞的照片(100×)。